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急性白血病的诊断与分型陆道培血液.肿瘤中心童春容Tongcr.21@163.com13601301042正常血液/免疫细胞发育过程造血干细胞淋巴系祖细胞髓系祖细胞红系/巨核系祖细胞单核/树突祖细胞粒/单系祖细胞早幼粒细胞嗜碱粒细胞嗜中粒细胞嗜酸粒细胞树突细胞单核细胞原始红细胞原始巨核细胞血小板红细胞原始B细胞原始T细胞B细胞T细胞浆细胞白血病的定义•白血病是一组造血干/祖细胞恶变导致分化阻滞、凋亡障碍的异质性恶性肿瘤性疾病。绝大多数表现为骨髓(BM)和/或血液(PB)中的恶性造血系统或免疫系统细胞增加。•急性白血病为原始恶性造血细胞明显增加的疾病。一般表现为乏力、面色苍白等贫血症状，出血，发热等感染症状，白血病细胞浸润导致多部位肿块、肿胀等症状；起病快，从发病到就诊一般数天至一个月•造血干/祖细胞恶变还可导致恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增殖性肿瘤(MPN)、骨髓增生异常综合征(MDS),这些疾病有时候难以和白血病鉴别，有些淋巴瘤、MPN、MDS和白血病仅仅是数量的差异，其疾病性质相似。如淋巴母细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病的差异主要是后者骨髓或血液恶性原始淋巴细胞25%，其治疗原则和方案一致。•世界卫生组织将造血干/祖细胞恶性肿瘤统一进行分类（见附表）。白血病分型的发展历史1.FAB分型:1976年首次提出，1980、81、85、91年逐步完善。以细胞形态学及细胞化学染色•AML:M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7•ALL:L1、L2、L33WHO分型:1995年开始，分别于2001、2004、2008年修订。联合细胞形态、细胞化学、免疫学、染色体、FISH、基因、组织病理及免疫组化急性白血病诊断的要求•全面正确诊断与分型•评估预后•确立检测MRD的标志，追踪MRD•指导个性化治疗：•了解危险分层；•发现靶向治疗标记；•发现抗原丢失、克隆演变或突变•帮助确定病因或发病机制MICM整合诊断技术•M:形态学、细胞化学、病理•I:免疫学，包括免疫组化、流式细胞分析•C:染色体、荧光标记探针的原位杂交(FISH)•M:分子生物学：白血病融合基因、基因突变、克隆性基因重排、正常基因表达水平过高诊断与分型形态或加细胞化学分析受观察者个体经验及分辨力的限制，一致率仅50-70%；病理对及免疫组化对诊断伴骨纤的患者具有重要价值在此基础上增加免疫组化和/或FCM分析大大增加了分型的准确率，可达90%以上；染色体、FISH及基因分析，进一步提高分型的准确率细胞形态及细胞化学分析的优缺点直观：直接观察细胞形态，对MDS的诊断、一些少见的、大的恶性细胞的确定优于FCM细胞一般是第一针标本，很少稀释，几乎未处理，因此恶性细胞的比例更准确经济、快速人为因素影响大：仅根据形态学诊断急性白血病，FAB专家的一致率仅50-70%难以鉴别细胞的成熟阶段，B、T等系列的恶性细胞细胞较成熟时，难以鉴别良恶性预后价值不太大树脂切片：红系增生活跃，原早（部分细胞体积偏大）阶段细胞可见小堆，中晚阶段细胞可见小片状分布。Gomori：++++石蜡切片IHC:CD61染色提示小巨核细胞异常增生，且存在聚集现象（MDS特征性改变之一）。CD235a染色提示红系成片状增生MDS伴骨髓纤维化病理及免疫组织化学的优缺点•标本直接固定，不容易损失信息，恶性细胞比例更客观，对一些抽不出或少见细胞，仍可诊断。如伴骨髓纤维化、MM、淋巴瘤、转移癌、组织细胞、巨噬细胞、树突细胞、何杰金细胞等•可以直接观察到组织结构，容易确定恶性细胞的组织部位•诊断慢、受诊断者个人经验及知识水平影响大•对一些组织结构无破坏、细胞形态改变不大的细胞，难以鉴定良恶性及成熟度•有些恶性细胞在液体中，难以获取组织标本，难以判断组织结构FCM的工作原理摘自FlowCytometry:FirstPrincipleFCM检测的参数•FSC:细胞大小•SSC:细胞内颗粒多少及细胞内构造的复杂性•FL：3-10多种正常BM细胞的图形：SSC按对数收集病例二(本院）FCM的优缺点•一次可检测数万至数十万个细胞上的数十种标记，可同时检测每个细胞的六个以上参数，敏感性高，分析全面•更容易区分良恶性，恶性细胞的系列及成熟度•可帮助确定免疫治疗的靶点并监测疗效，如CD20、CD19、MHC分子等。是监测MRD覆盖面最广的方法。•快速、简便、重复性好•不能确定组织结构，一些罕见的大细胞不能分析到，一些细胞粘附性高，难以抽出。因此对HL等难以确诊。•染色、洗涤等细胞处理中会损失一些细胞，尤其是DLBCL、幼稚红细胞，因此有时判断恶性细胞的比例不如形态准确，对M6、MDS的诊断不如形态•预后价值不如染色体和基因•可以发现很多未知基因的染色体异常•有独立的诊断及预后价值•诊断时间长•高度依赖诊断人员的丰富的技术、经验及知识水平•如果恶性细胞不分裂，其结果是假阴性•由于分析的细胞少，多数白血病患者无染色体异常，监测残留白血病不敏感染色体的优缺点•一些染色体有诊断价值:如重现性染色体异常，如t(8;21)，inv(16)、他（16；16）、t(15;17)（q22;q12），t(5;14)(q31;q32)，t(3;3),t(4;11)可直接诊断急性白血病；•一些染色体和/或基因有辅助诊断价值，如5q31、CEP7、7q31、CEP8、20q、CEPY、P53高度疑似MDS等；•有-7、5q-、t(3;3)、t(4;11)、t(9;22)、复杂染色体等的急性白血病预后不好；染色体的诊断价值男，13岁，外院诊断为AML-M5,初治时无染色体结果。CR后在XX医院查AML1-ETO基因阳性，染色体46,XY[20]。评估是否需做骨髓移植，遂查初诊时骨髓涂片FISH，是否伴-Y。结果：76%的细胞伴-Y，需移植。红色信号为：Y，绿色信号为：X；多数细胞中丢失Y信号BCR/ABL阴性（信号类型：两红两绿）患者，男，6岁，外院行BCR-ABL定性+诊断为ph+ALL,未做染色体，化疗及格列卫治疗CR后来我院。将初治的基因做BCR-ABL定量0.59%.将初治的BM片回顾FISH•有独立的诊断及预后价值•可以检测出显微镜下人眼难以分辨的染色体异常•诊断时间比染色体短•与染色体分析比较，对依断人员的经验依赖程度低•对不分裂的细胞也可以分析，分析的细胞数量比染色体多，更能反映正常和恶性细胞的比例，监测残留白血病比染色体敏感。•可以对既往的骨髓片回顾分析，进一步明确或排除诊断•探针昂贵，每次只能分析1-2种异常，只能分析已知的染色体或基因异常FISH的优缺点31种白血病融合基因(122种变异体)筛查1.AML1/EAP(1)2.AML1/ETO(1)3.AML1/MDS1(2)4.BCR/ABL(4)5.CBFβ/MYH11(8)6.DEK/CAN(1)7.dupMLL(5)8.E2A/HLF(3)9.E2A/PBX1(2)10.FIP1L1/PDGFRα(4)11.MLL/AF10(18)12.MLL/AF17(1)13.MLL/AF1p(4)14.MLL/AF1q(4)15.MLL/AF4(12)16.MLL/AF6(4)17.MLL/AF9(8)18.MLL/AFX(4)19.MLL/ELL(8)20.MLL/ENL(4)21.NPM/ALK(1)22.NPM/MLF1(1)23.NPM/RARα(2)24.PLZF/RARα(2)25.PML/RARα(5)26.SET/CAN(1)27.SIL/TAL1(1)28.TEL/ABL(2)29.TEL/AML1(2)30.TEL/PDGFR(1)31.TLS/ERG(5)患者正常与10%肿瘤细胞混合正常IgH基因重排结果测序图比较李**KIT基因突变KIT基因野生型（WT）•有独立的诊断及预后价值•可以检测出染色体或FISH不能检测出的异常，联合染色体和FISH，增加了对疾病预后的判断能力。•诊断时间比染色体及FISH短•与染色体及FISH分析比较，对检测人员的经验依赖程度低•是最敏感的监测残留白血病的指标•对试验设计、试验质控要求高•对无基因异常的疾病难以诊断•疾病是复杂的，仅有基因异常未必完全决定预后基因检测的优缺点急性白血病的诊断标准(WHO)BM形态学分型幼红细胞≧50%ANC幼红细胞﹤50%ANC原始细胞≧30%NEC原始细胞﹤30%NEC原始细胞≧30%NEC原始细胞﹤30%NECAML-M6MDSAML,M0-M5,M7ANC：全部有核细胞；NEC：除有核红细胞、浆细胞、淋巴细胞、组织嗜碱细胞、巨噬细胞以外的有核细胞，主要包括粒细胞、单核细胞•BM穿刺干抽时，要进行BM活检印片、病理及IHC分析，当CD34+细胞20%可诊断AML•BM稀释可降低原始细胞，应结合多张涂片分类的结果报告•对多数AL的诊断，原始细胞不包括原红细胞，但纯红血病，不成熟的有核红细胞80%，以未分化或原始红细胞为主•伴BM纤维化的急性全髓性增生的原始细胞比例不定，诊断主要根据临床急性起病的高热、骨痛、全血细胞减少，发展迅速；BM病理显示在BM纤维化的基础上红系、粒系及巨核细胞系异常幼稚细胞增生，细胞增生异常。•髓系肉瘤列为AML，BM或PB未见白血病原始细胞•有AL重现性染色体和/或基因异常者，如t(8;21)/AML1-ETO，inv(16)/CBFβ/MYH11、t(15;17)（q22;q12）和/或PML-RARA,t(5;14)(q31;q32)和/或IL3-IGH等原始细胞20%也可诊断为AL的情况白血病的诊断与分类步骤•增加的血液细胞是良性还是恶性•前体与外周(成熟)恶性淋巴瘤/白血病的区别，也就是急性和慢性白血病的区别•恶性细胞的系列来源•预后分型•治疗靶点分型白血病的诊断与分类步骤•增加的血液细胞是良性还是恶性•细胞形态：急性白血病原始细胞明显增加，一些白血病有明显的特征，如aure’s小体；APL的异常早幼粒细胞有外浆、大量的颗粒等•免疫标志异常表达：跨系表达、早晚期同时表达、罕见细胞大量存在等•单克隆轻链表达、克隆性TCR基因重排、DNA异常•急性白血病特有的染色体和/或基因肿瘤细胞DNA倍体分析恶性前体与外周（成熟）淋巴细胞疾病的鉴别•前体细胞型:ALL,淋巴母细胞淋巴瘤•B:除了B细胞标志外,CD45dim/-、CD34+、TdT+、CD10+•T:除了T细胞标志外,CD45dim/-、CD34+、TdT+、cCD3+、sCD3-、CD1a•外周(成熟)细胞：无以上前体细胞标记•B•T髓系MPO+（用FCM，免疫组织化学染色，细胞化学染色证实）或单核细胞（至少有以下标志中的2项阳性：NSE、CD11c、CD14、CD64、CD36*、溶酶体T细胞系cCD3+(用抗CD3ε链的单抗及FCM分析，不能用免疫组化的抗CD3ζ链多克隆来检测，因为后者不是T细胞特异性抗原)或sCD3+B细胞系CD19强阳性并同时有以下标志中的至少1项阳性：CD79a、cCD22、CD10或CD19弱阳性并同时有以下标志中的至少2项阳性：CD79a、cCD22、CD10白血病细胞的系列特异性标志如有2系或以上的特异性标志，可诊断为急性混合性白血病白血病细胞的系列特异性标志原始嗜碱细胞：甲苯胺蓝阳性，酸性磷酸酶弥漫阳性；MPO-、MPO-SBB-、CAE-、NSE-，类胰蛋白酶-；CD123+、CD203C+、CD11b+、CD13+、CD33+、Dr+、CD9+，CD34可阳性，CD117-、CD25-。原始巨核细胞：除了CD13+、CD33+外，CD41+、CD61+、CD36+；常为CD34-、MPO-、CD45-、Dr-；其它髓系标志常阴性原始红细胞：HbA+，血型搪蛋白-或dim、CD71+或dim，CD117可阳性；MPO-、CD34-、Dr-、CD45-；其它髓系表型常阴性原始浆细胞样树突细胞：CD4+、CD56+、CD123+、BDCA-2+、CD303+、TCL1+、CLA+、MxA+、颗粒酶B+、穿孔素+、TIA1+；50%