病毒的形态学诊断

实验十病毒的形态学诊断、培养方法和血清学试验目的（一）观察病毒包涵体，并掌握其诊断意义。（二）掌握病毒的形态并了解病毒包膜的获得。（三）了解病毒培养的三种方法。（四）掌握病毒学中主要血清学反应的原理（五）熟悉病毒血凝抑制试验的测定过程内容（一）病毒的形态学诊断1.病毒的电镜照片（示教）2.狂犬病毒包涵体（示教）3.麻疹病毒包涵体（示教）（二）病毒的培养法（录像）1.病毒的动物接种法2.病毒鸡胚培养法3.病毒的组织培养法（三）血凝抑制试验（操作）一、病毒的形态学诊断病毒形态学研究方法可分为两种：一种是应用电子显微镜技术，观察其大小，形态及排列特征，以帮助诊断；另一种是应用光学显微镜通过涂片染色或切片染色，观察包涵体。病毒感染细胞所产生的包涵体，其特征基本是固定的，故对病毒性疾病的诊断具有一定价值。【方法】（一）病毒的电镜照片（示教）观察腺病毒、疱疹病毒的电镜照片，注意其形态结构、大小、排列、及其包膜的形成。（二）狂犬病病毒内基（Negri）包涵体（示教）用高倍镜或油镜观察经HE（苏木紫-伊红染色）染色的死于狂犬病的犬脑组织切片，注意包涵体在细胞内的形态、位置及染色性。（三）麻疹病毒包涵体（示教）用高倍镜或油镜观察经麻疹病毒培养后，HE染色的人胚或羊膜细胞标本片，注意包涵体在细胞内的位置、形态、染色性以及细胞融合情况。2二、病毒动物接种法实验动物在病毒学研究中有四方面用途：①分离鉴定病毒，如乙脑病毒；②连续传代通过，以减弱有毒株对人的致病力，如狂犬病病毒；③制备抗血清；④病毒致病机理的研究。常用的实验动物有小白鼠、地鼠、豚鼠、家兔、绵羊、鸡、猴等。在病毒学研究中，动物接种时为避免动物本身可能带有病毒，多采用实验室自己繁殖的动物。首先根据研究目的选择动物种类，对病毒致病机制的研究，则选择愈接近人类的高等动物（例如灵长类）研究结果愈有价值；其次要注意动物的年龄、性别和接种的途径等各种因素，一般年幼的动物比成年动物对病毒的敏感性高。至于接种的途径应根据病毒的嗜性决定，例如脑炎病毒以脑内注射最敏感。（一）小白鼠尾静脉接种（录像）【材料】1.动物：小白鼠2.病毒悬液3.碘酒、酒精、二甲苯、无菌0.25ml注射器、4号针头及小铝匣【方法】1.将小白鼠固定在小铝匣内，露出尾部，用碘酒消毒尾部，然后用酒精棉球连续擦尾部皮肤（必要时用二甲苯擦）使血管扩张。2.尾背和左右两侧三根血管皆为静脉，可选一根扩张较好的静脉作接种用。左手拇指捏住尾部的远端，向下弯45°，右手持注射器，于弯处进针静脉，推液0.1毫升。注意：推注时遇阻力且皮下隆起发白时，表示针头不在血管内应拔出重新进针；如针头在血管内，推注时不感阻力，且可看到血管中血液由于注入液体而后退。接种后逐日观察动物发病情况。（二）小白鼠鼻内接种（录像）【材料】小白鼠、流感病毒鼠肺适应株病毒悬液、无菌小试管、无菌毛细管、麻醉用乙醚、棉球及小玻瓶。【方法】1.首先将沾有乙醚的棉球放入一清洁小玻瓶内。左手握小瓶，右手抓住小白鼠，将其头部塞入瓶口，进行全身麻醉。注意麻醉深度，不宜太浅或太深，太深时易遭致麻醉死亡或非特异性吸入性肺炎，太浅则易在滴种时打喷嚏。2.用无菌毛细吸管吸取病毒悬液少许，连同毛细吸管插在无菌试管中备用。3.用左手将小白鼠握在手掌中，大拇指及食指抓住小白鼠耳部使其头部朝前并3呈仰卧位置，另一手取事先吸有病毒悬液的吸管，慢慢滴出一点于滴管口而不使其自然掉落，呈悬滴状。将悬滴靠近动物鼻尖，动物在呼吸时自然吸入，一般为0.03～0.05毫升，不宜过多。4.小白鼠慢慢苏醒，在饲养盒中逐日开始发病，发病的症状常为毛耸、咳嗽、不食、甚至死亡。解剖尸体可观察到肺炎或血性病灶。（三）小白鼠脑内接种（录像）【材料】脑炎病毒（小白鼠脑脊髓炎病毒）悬液。脑组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加10％脱脂奶盐水研磨成10－1悬液，然后用3000转/分离心沉淀30分钟，吸取上清液供接种用。小白鼠：3周龄，体重6～8克。无菌0.25毫升注射器及针头（4号）、煮针锅、碘酊、棉签。【方法】1.以无菌0.25毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升，去除注射器内的气泡。2.取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指捏住小白鼠的头部，左手手掌轻轻按住小白鼠的体部。3.右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠颞部皮毛（不碰到眼）。4.右手拿注射器在小白鼠颞部（眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向）刺入，进入颅腔，进针2～3毫米，不要插得太深，注射量为0.02～0.03毫升。5.注射完毕，将用过得注射器放入煮针锅内煮沸消毒。动物一般在3～4天后开始发病，食欲减退，活动迟钝，毛耸，震颤，慢慢发展为麻痹，瘫痪而死亡。本法适用于一些脑炎病毒的分离培养。三、病毒鸡胚培养法鸡胚培养法常用于痘类病毒、粘病毒和疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原、生产疫苗以及研究病毒性质等。鸡胚和实验动物一样，为一整体动物，有神经血管的分布及脏器的构造；鸡胚的组织分化程度低，病毒易于繁殖，感染了病毒的膜结构和液体中，含有大量病毒；鸡胚来源充足，操作简单、通常本身是无菌的，对接种的病毒不产生抗体为其优点，但除产生痘疱的病毒及引起鸡胚死亡的病毒外，通常不产生特异性的感染指征，必须利用第二个试验系统来测定病毒的增殖。常用的鸡胚接种方法有四种，即绒毛尿囊膜上接种法、羊膜腔接种法、尿囊接种法及卵黄囊接种法。根据不同病毒和不同目的采用合适的接种方法。（一）尿囊腔接种法（录像）【材料】副流感病毒10－3稀释液，10～12日龄鸡胚、无菌1毫升注射器及7号针头、电4动磨蛋器、检蛋灯、弯头小镊子、蛋架、碘酒棉球、胶布、大头针、无菌试管、无菌毛细吸管。【方法】1.选用10～12日龄鸡胚，在照蛋灯上照视观察鸡胚是否存活，根据如下：①小血管是否清晰；②胚胎是否活动，观察小鸡的眼睛黑点是否移动；③蛋白一边和胎盘一边是否界限分明，蛋白一边较亮，胎盘一边暗红色，如果胎盘一边发黑或苍白都表示胚蛋已死亡。用铅笔标明天然气室，鸡胚及大血管位置，然后在绒毛尿囊膜发育区避开大血管的地方作一记号，定为注射入口。绒毛尿囊膜区血管丰富，在照视时呈现红色，几乎占据鸡蛋的二分之一。2.用碘酒消毒注射入口和天然气室端的蛋壳，再用电动磨蛋器于注射入口和天然气室端的蛋壳上磨一小孔，勿伤及卵膜。3．用大头针通过火焰消毒后刺穿气室端所开小孔的卵膜，这样可避免在注射时液体回流出来。4．将鸡胚横卧于蛋架上，用无菌1毫升注射器抽取病毒液体，针头于卵壳成30°交角，由注射小孔刺入0.5～1.0厘米，注射0.1～0.2毫升（图10-1）。5．注射完结用胶布封口。封口前胶布用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。用过的注射器用煮沸法消毒，鸡胚放入35～37℃培养。6．注射后次日，逐日观察鸡胚生活情况，孵育48～72小时后移入4℃冰箱。注意鸡胚必须直立，令气室端朝上。7．收获尿囊液之前取出鸡胚，用碘酒消毒气室端，并用镊子击破气室端卵壳，沿气室边缘小心打开一大缺口，然后用小镊子撕去卵膜及撕破绒毛尿囊膜，最后用毛细管吸取尿囊液，一般可吸得4～5毫升。8．滴定尿囊液的病毒血凝效价。尿囊接种法适用于某些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒、新城鸡瘟病毒等的培养，惟分离培养不如羊膜腔接种法阳性率高。（二）绒毛尿囊膜上接种法（录像）【材料】尿囊液卵黄囊气室羊水卵白图10-1鸡胚尿囊腔接种法5牛痘苗病毒10－3稀释液、10～13日龄鸡胚、橡皮乳头、眼科镊子或小剪刀、无菌培养皿、无菌生理盐水，其余同《尿囊腔接种法》。【方法】1．选用10～13日龄鸡胚，在照蛋灯上照视观察是否活胚蛋，用铅笔划下绒毛尿囊膜发育的界限。2．将胚蛋横卧于蛋座上，使其绒毛尿囊膜部位朝上，用碘酒消毒绒毛尿囊膜部位和天然气室端的中心部，待干后即用磨蛋器轻轻在绒毛尿囊膜中心部磨一三角形窗口（每边一厘米许），磨破卵壳而不使卵膜破裂，同时用磨蛋器于气室端开一小孔。注意：已磨好之鸡胚必须于1～2小时内接种，否则绒毛尿囊膜易与卵壳粘着。3．用分离针或大头针通过火焰消毒，穿通天然气室端所锯小孔；并用分离针或大头针轻轻划破卵壳，露出三角形卵膜，最好将分离针或大头针30°角度自上往下压迫卵膜一个小口，这样不致损伤绒毛尿囊膜。4．立即用橡皮乳头在天然气室一端小孔吸气2～3次，目的将天然气室的空气吸去，而上面所开的洞口进入空气，形成一个人工气室，可在照蛋灯上照视一下，看天然气室是否消失，如未消失则尚需再吸气数次（图10-2）。5．用小镊子通过火焰灭菌，稍待冷却后将三角形窗口的卵膜撕去、暂时盖以无菌培养皿防止污染，然后用消毒注射器吸取牛痘苗悬液（10－3稀释液，内加适量的链霉素及青霉素），揭去培养皿，于窗口滴入0.1～0.2毫升病毒液，注毕后窗口用胶布封口，封口前胶布用碘酒消毒，并通过火焰，烧去余碘。用过的注射器煮沸消毒。6．孵育于37℃温箱，每日观察生活情况，接种10－3稀释的牛痘苗后的鸡胚一般不死亡，但也可能在3天之后发生死亡，如发现死亡则立即放入普通冰箱，如不死亡则培养4～5日后放入普通冰箱，等待观察检查。7．将感染病毒的鸡胚自冰箱中取出，用碘酒消毒人工气室面，然后用镊子撕去胶布并将卵壳的三角形窗口扩大，以便剪取绒毛膜，此时在明亮处可清楚地看到牛痘斑，呈白色点状，有时融合成一堆或一片。8．左手用小镊子镊起绒毛尿囊膜，右手用小剪顺卵壳四周剪下绒毛尿囊膜放入无菌培养皿内，并用无菌生理盐水洗涤1～2次，再将膜张开，膜上牛痘斑就看得更为清楚。绒毛尿囊膜上接种法，除适用于天花，牛痘等病毒外，尚适用于单纯疱疹病毒和其它一些病毒，但其它一些病毒不如天花、牛痘、单疱疹病毒那样具有明显的病斑。卵白羊水绒毛尿囊膜卵黄囊尿囊液6（三）羊膜腔接种法（录像）【材料】副流感病毒10－3稀释液、9～10日龄鸡胚、灭菌液体石蜡、其余同《尿囊腔接种法》。【方法】1．所用鸡胚在使用前一天，将鸡胚直立卵盘培养，使其胚胎向上，便于操作。2．接种前检查鸡胚生活情况，并用铅笔画出天然气室和胚胎的位置，然后用磨蛋器沿天然气室的边缘和胚胎位置近处，锯一方形小窗（每边约1厘米许，如图10-3）。3．用小镊子挑去方形卵壳和撕去卵膜，再用无菌吸管，吸取石蜡油少许，滴入2滴，石蜡油在气室面的卵膜上很快散开，使膜透明，这样在鸡蛋照明灯或检蛋灯上，可清楚地观察到整个鸡胚。4．用无菌1毫升注射器抽取少许流感病毒液体，将鸡蛋直立于照明灯或检蛋灯上，针头自窗口对着鸡胚直下，穿过绒毛尿囊膜，羊膜腔、推动注射器，注入0.1～0.2毫升，针头刺入时注意勿伤及鸡胚本身，最好从小鸡的颈部空隙中插入。5．注射完毕后，用胶布封口（胶布先经碘酒消毒和通过火焰烧去余碘处理）。用过的注射器煮沸消毒处理。鸡胚放入35～37℃培养48～72小时。6．自注射后次日起逐日检查鸡胚的生活情况，2日以内死亡者多为非特异性损伤而致死；2日后死亡者视为特异性死亡，流感或副流感病毒10－3稀释注射时，一般不引起死亡。收获病毒之前将鸡胚移入普通冰箱18～24小时，将鸡胚冻死，以减少收获时的出血。7．冰箱取出鸡胚，碘酒消毒鸡蛋气室端，撕去胶布并将蛋壳窗口扩大，用小镊子撕破卵膜及绒毛尿囊膜，然后用毛细管吸出尿囊液弃去，尿囊液吸完后，左手持镊子镊住羊膜腔，右手以毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水，一般羊水可吸出一毫升左右。8．滴定羊水的病毒血凝效价。羊膜腔接种方法适用于一些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒及流行性腮腺炎病毒等的分离。图10-2鸡胚绒毛尿囊膜上接种尿囊液气室卵白羊水卵黄囊图10-3羊膜腔接种法7四、病毒细胞培养法及病变观察（录像）细胞培养法是目前培养病毒应用最广的一种培养方法，其优点是（1）经济适用，结果正确且敏感；（2）较实验动物易于控制。细胞培养法多应用于病毒的分离培养，进行血清中和试验及制造疫苗和抗原等方面。很多组织细胞，包括鸡胚、鼠胚、各种动物的肾组织细胞，人胚羊膜组织细胞或流产胎儿组织细胞（应在死后6小时内采取，因时间过长，组织细胞生长成功率下降）等均可作细胞培养的来源。细胞的选择主要依据组织细胞对病毒的敏感性。能引起病变的组织细胞，往往取自病毒的自然宿主，特别是引起疾病的宿主的某些脏器组织细胞。人类病