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第十五章酵母菌基因工程酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。共有56属和500多个种组成。酵母是最成熟的真核生物表达系统。第一节简介一．发展历程1.1974，Rlarck-walker和Miklos发现在大多数酵母中存在质粒。2.1978，Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。3.1981，Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。4.1983，我国首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。5.1996，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。二．酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统1.优势在于：①安全无毒，不致病；②有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；③易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；④培养条件简单，容易进行高密度发酵；⑤能将外源基因表达产物分泌到培养基中；⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。2.缺陷在于：①表达效率相对低；②酵母常有密码子偏爱性，真核基因在其中表达时需要人工修正。三．酵母基因工程的发展现状目前酵母基因工程中发展和应用较多有酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母等，其应用主要体现在以下两方面：1.酿酒酵母的自身改造：①将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母（可自身分泌葡萄糖淀粉酶）。②将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母（可自身分泌蛋白水解酶）③将β-葡聚糖酶基因导入酿酒酵母（可有效降解麦芽汁中的β-葡聚糖，改善啤酒的过滤效率）④将ATP硫酸化酶和腺苷酸硫酸激酶在酿酒酵母体内表达（促进SO2的生成，维持啤酒风味的稳定）⑤将人血清清蛋白（HAS）基因转化到酿酒酵母（生产出富含HAS的啤酒新品种）2.酵母表达异源蛋白①表达水平:酵母表达系统主要用于表达外源基因，表达水平的高低直接关系到其应用价值。酵母的高效表达从三方面实现：A.通过开发高效的启动子提高和控制外源基因的转录水平。B.提高表达载体在细胞中的稳定性。C.通过多次同源重组以及rDNA介导的整合两种方式提高表达基因在细胞中的拷贝数。②表达质量：除表达水平外，外源基因表达质量的好坏也直接关系到酵母表达系统的应用价值。3.酵母基因工程的发展趋势①解决酵母基因工程中还存在的缺陷；②在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向；③利用酵母基因工程筛选更多的制药；④改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本；⑤酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注。广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌第二节、酵母菌的宿主系统一．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想属名举例酵母属酿酒酵母克鲁维酵母属乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属巴斯德毕赤酵母裂殖酵母属非洲酒裂殖酵母汉逊酵母属多态汉逊酵母二．提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变利用经典诱变技术筛选分离酿酒酵母的核突变株或细胞质突变株，可以提高重组异源蛋白在酵母菌中的合成产率。然而，有些在表型上能提高某种特定异源蛋白表达的突变株未必具有促进其它外源基因表达的能力，因为提高一种特定异源蛋白合成和分泌的影响因素极其复杂，其中包括表达产物本身的生物化学和生物物理特性，只有那些能促进任何外源基因分泌表达的基因型稳定突变株，才能用作理想的基因工程受体细胞。许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。三．抑制超糖基化作用的突变宿主菌酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修饰和加工系统对来自高等动物和人的异源蛋白活性表达是极为有利的，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。突变类型生物效应mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天门冬酰胺侧链糖基化缺陷och外侧糖链添加缺陷型这些突变菌株不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链，这是酿酒酵母超糖基化的一种主要形式。含有mnn9突变的酵母菌细胞缺少能聚合外侧糖链的a-1,6-甘露糖基转移酶活性，而och1突变株则不能产生膜结合型的甘露糖基转移酶。尽管其它类型的突变株尚未进行有效的鉴定，但它们却能使异源蛋白在天门冬酰胺侧链上进行有限度的糖基化作用，基本上杜绝了糖基外链无节制延长的超糖基化副反应。4.减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用A.第一类基因含有多个泛蛋白因子编码重复序列，各重复序列头尾相连形成多拷贝结构；①酵母菌的泛蛋白因子编码基因分为两大类：B.第二类基因为单一泛蛋白因子编码序列与另一个不相关的多肽编码序列的融合基因，后者称为羧基延伸蛋白（CEP），它也有两种大小不同的序列，其中CEP52由52个氨基酸残基组成，而CEP76-80则由76-80个氨基酸残基组成。②在酵母菌中共有四个基因编码泛蛋白因子：UBI1和UBI2编码融合蛋白泛蛋白-CEP52UBI3编码泛蛋白-CEP76UBI4则编码一个五聚体泛蛋白因子UBI1、UBI2和UBI3基因均能在酵母菌对数生长期内表达，当菌体进入稳定期后便自动关闭，UBI4的表达时序与前三种基因恰好相反，这说明四种基因编码产物的生物学功能并不完全相同。A.第一类基因包括UBC4、UBC5和UBC7，其编码产物只拥有相应的保守结构域，多肽序列的其它区域并没有明显的同源性，这些蛋白形成泛蛋白-靶蛋白共价接合物的活性严格依赖于E3蛋白的存在；③几个编码泛蛋白因子接合酶系统的酵母菌基因（UBC）B.第二类基因包括UBC1、UBC2、UBC3和UBC6，它们的表达产物具有天然的C端延伸活性，不需要E2蛋白的参与便可进行泛蛋白的接合反应。④如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种降解作用减少到最低程度：A.第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速被转位到分泌器中，即可有效避免降解作用；B.第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失；C.第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变株作为外源基因表达的受体细胞。A.UBI4缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。⑤减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌：泛素降解途径衰减的酿酒酵母B.UBA1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。C.Ubc4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。五．内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌酿酒酵母拥有二十多种蛋白酶，尽管不是所有的蛋白酶都能降解外源基因表达产物，但实验结果表明有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。将大肠杆菌的lacZ作为报告基因分别导入两株具有相同遗传背景的酿酒酵母菌中，其中一株含有编码空泡蛋白酶基因PEP4的野生型菌株，另一株则为pep4-3突变株，比较这两株菌中b-半乳糖苷酶的活性，在同等试验条件下pep4-3突变株中的b-半乳糖苷酶活性明显高于PEP4+的野生菌，而且在间歇式发酵罐中，pep4-3突变株也能长到相当高的密度。PEP4蛋白酶除了具有降解蛋白质的功能外，还能对某些重组异源蛋白进行加工。例如，MFa1-人神经生长因子（hNGF）原前体的融合蛋白只能在pep4突变株细胞中进行正确的加工剪切，这说明PEP4蛋白酶或者细胞内其它一些被PEP4蛋白酶激活和修饰的蛋白酶系统与重组异源蛋白的正确加工剪切过程有关。第三节、酵母菌的载体系统载体的一般结构：选择标记复制子表达盒启动子先导序列终止子有用的蛋白结构域一．酵母菌种的野生型质粒1.酿酒酵母中的2μ环状质粒①几乎所有的酿酒酵母都含有2μ双链环状质粒，拷贝数维持50-100个。②Irs反向重复序列600bp，重组FLP编码产物驱动Irs的同源重组，REP编码产物控制质粒的稳定性，STB是REP的结合位点。③接合酵母属中的pSRI、pSR1、pSB2和pSR1以及克鲁维酵母属中的pKD1质粒等，均有类似的结构。2.乳酸克鲁维酵母中的线性质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100个，分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的毒素蛋白基因。二．酵母菌克隆表达质粒的构建①能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数，可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增；1.酵母克隆表达质粒的特点：②含有在酵母中便于选择的遗传标记，这些标记一般能和酵母相应的突变体互补，如Leu+、His+、Ura+、Trp+等，有些还携带用于大肠杆菌的抗生素抗性标记；③含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。①ARS为酵母菌中的自主复制序列，大小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp就有一个ARS元件。2.含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建②由染色体ARS构成的质粒称为YRp，而由2μ质粒构建的杂合质粒为YEp。③上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但是经过几代培养后，质粒丢失率达50%-70%，主要由于分配不均匀所致。①CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列。将CEN插入到ARS质粒中，获得的新载体称为YCp。②YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数通常只有1-5个。3.含有CEN的YCp质粒的构建①利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元件构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大片段的外源DNA，这是构建YAC载体的基本思路②YAC载体的装载量可高达800kb，适用于构建人的基因组文库。4.含有TEL的YAC质粒的构建5.整合型质粒载体YIP及其构建①YIP载体由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段组成，可与受体或宿主的染色体DNA同源重组，整合进入宿主染色体中，酵母片段只提供选择性标志，没有复制起点。②转化率低（只有1-10转化子/微克DNA），但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析。6.复制型质粒载体YRP及其构建①同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，又称穿梭载体；②带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。③优缺点：转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失。7.附加体型质粒载体YEP及其构建①由大肠杆菌质粒、2u质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2u质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区，STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。对酵母基因很高的转化活性，比YRP型载体更稳定，拷贝数也高，是基因克隆中的常用载体。YEp13质粒载体PYF92：酵母的2μ质粒pBR322质粒酵母的His+基因8.酵母人工染色体载体（YAC）YAC载体是由酵母染色体中分离出来的DNA复制起始序列、着丝点、端粒以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体。YAC载体是以质粒的形式出现，长度约11.4kb，带有人工染色体所需的一切元件。每个YAC载体可以装进100万碱基以上的大片段DNA，比柯斯质粒的装载能力要大得多。复制元件：YAC载体的复制元件是其核心组成成分自主复制序列用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒两个端粒标记基因：主要采用营养缺陷型基因，Trp+、Leu+、His+、Ura+等第四节、酵母菌的转化系统一．酵母菌的转化程序二．转化质粒在酵母细胞中的命运三．用于转化子筛选的标记基因一．酵母菌的转化程序1.酵母菌原生质体转化法早期酵母