PCR扩增检测乙肝病毒

实验三：PCR扩增检测乙肝病毒乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我国发病率很高，HBV的检测极其重要。HBVDNA存在就可以引起乙肝的传染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒复制的发动机。PCR技术可以检测出极微量的病毒，是判断其传染性最直接、最可靠的证据。PCR技术已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察及预防研究工作最理想的方法之一。一、实验目的1.掌握PCR技术扩增的原理2.熟悉PCR扩增检测乙肝病毒的基本操作过程。二、实验原理聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称PCR,是在体外条件下利用DNA聚合酶、催化一对引物间的特异性DNA片段合成的基因体外扩增技术，它包括三个基本过程：1.变性：加热使双链DNA变为单链2.退火：急速降温使引物和互补模板在局部形成杂交链3.延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应模板DNA高温变性低温退火引物适温延伸经过25-35次循环后，目的片段扩增2n倍两条子代DNA一次循环Tap酶5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’三、主要器材及试剂1.主要器材：9700型PCR仪电泳槽、电泳仪紫外分析仪台式高速离心机2.主要试剂：HBV-PCR定性检测试剂盒PCR反应管HBV阳性标本DNA提取液四、操作步骤1.标本处理：取患者血清40μl，加入DNA提取液40μl，沸水浴10分钟，10000转离心5分钟，取上清液4μl做PCR反应。2.加样：加入提取好的标本4μl，6000转离心10秒。取试剂盒中PCR反应管TapDNA聚合酶10×扩增缓冲液4种dNTP混合物引物(小分子DNA片段）Mg2+三个扩增步骤温度及时间温度时间变性93℃45″（首次5′）退火55℃45″延伸72℃60″（末次5′）循环次数：25次3.PCR仪上扩增：PCR仪上扩增加入标本离心6000转离心10秒4.电泳检测：①制备2%琼脂糖凝胶2%琼脂糖的制备：电泳槽的准备：称取0.8g琼脂糖40mlTBE电泳缓冲液（PH8.0)煮沸溶解加入冷却60℃左右加入溴乙啶EB20μl倒胶``②加样：取扩增后的产物10ul点样于凝胶孔取样点样③电泳：点样端接“-”，稳压，50V，电泳30分钟。五、结果观察：紫外分析仪下观察，出现橙黄色条带则为HBV阳性HBV阳性HBV阴性HBV阳性对照HBV阴性对照正极负极点样孔五、注意事项1.试剂盒内阳性标本及DNA提取液使用前需充分融化离心。2.反应液的表面为固体封盖剂，电泳取样时从反应管底部吸液。3.EB为强致癌物，操作过程应注意防护。4.注意无菌操作，以免出现假阳性。Thankyou!