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GEHealthcareLifeSciences应用文献28-9875-25AA亲和层析用于捕获高表达量单克隆抗体的MabSelectSuRe™LX的动态结合载量研究在不同的停留时间和物料浓度下测定用于捕获单克隆抗体的碱稳定性的、ProteinA来源的亲和层析介质（树脂）MabSelectSuReLX的动态结合载量（DBC）。DBC随着停留时间的增加而增加，而样品中单克隆抗体的浓度没有仸何显著的影响。也比较了MabSelectSuReLX和MabSelectSuRe对于七种不同的含有单克隆抗体物料的DBC。在较长的停留时间，MabSelectSuReLX显示出20%到46%的更高的DBC。幵分析了两者的生产力。结果表明，在整个寿命周期，MabSelectSuReLX能够比MabSelectSuRe纯化多达50%以上的抗体。介绍由于在单克隆抗体生产上更大的经济压力，在哺乳动物细胞培养液中抗体的表达量在过去的20年中已经被大大提高。今天我们通常可以看到1到8g/l的表达量，而且已经有高至15g/l或更高的物料表达水平的报道。对于生产中高效的层析纯化的需求也已经相应地提高。除非这种需求得到满足，纯化操作风险限制它们能够提供的通量，这将导致成本高昂的下游工艺的瓶颈问题。单克隆抗体纯化策略单克隆抗体的大规模纯化通常由两个或三个层析步骤组成，而proteinA是第一个捕获步骤所选择的亲和层析配体，因为它的高选择性提供高纯度（一般99%）和高产量。此外，基于proteinA的层析介质很容易在小规模和大规模使用。因此，proteinA层析介质形成用于单克隆抗体纯化的平台方法基础。随后可以使用各种层析技术及其组合技术进行下游加工，特别是离子交换、多模式和疏水作用层析。MabSelect™亲和层析介质的关键作用基于proteinA配体的MabSelect™家族的亲和层析层析介质（MabSelect,MabSelectXtra™和MabSelectSuRe）已经被生物制药单克隆抗体的大规模商业化厂商所广泛接受。MabSelect™家族的最近的一个新成员是MabSelectSuReLX，它是含有与MabSelectSuRe具有相同硬度的高流速琼脂糖基质和碱稳定性配体。MabSelectSuReLX因此享有相同的性能属性，例如碱和蛋白酶稳定性以及常规的洗脱。然而，与MabSelectSuRe相比，MabSelectSuReLX在稍长的停留时间提供增加20%以上的DBC。例如在6分钟停留时间，层析介质对人IgG的结合载量大约为60g/l。本研究通过测定不同停留时间和物料浓度时层析介质的DBC研究了单克隆抗体捕获期间MabSelectSuReLX的性能。来自MabSelectSuReLX的数据也与MabSelectSuRe进行了比较。此外，对于两种层析介质，也评估了工艺经济性参数，尤其是生产期间层析介质的生产力和利用率。材料与方法样品利用人IgG和含有各种单克隆抗体的澄清的CHO细胞上清液进行初始分析。样品制备澄清的CHO细胞培养液上清以天然状态被使用，或加入纯化的单克隆抗体到终浓度大约为5和10mgMAb/ml后被使用。所产生的单克隆抗体浓度使用1mlHiTrap™MabSelectSuRe层析柱通过分析层析进行分析。用于测定动态结合载量的初始分析MabSelectSuReLX和MabSelectSuRe装填在Tricorn™5/100层析柱中（床高度10cm，柱体积1.96ml）。利用天然和加入标准的物料进行初始分析。澄清的CHO细胞培养液上清被上样到层析柱上直到大约实现10%的穿透。然后用PBS缓冲液洗掉未结合的物质，用0.1M柠檬酸，pH3.0洗脱，用0.1MNaOH在位清洗（CIP）。上样期间所选择的组分在HiTrapMabSelectSuRe层析柱上使用上述指定的缓冲液进行分析。洗脱峰被合幵在一起，它们以mAU×ml表示的峰面积与起始原料的峰面积进行比较。利用起始原料中10%峰面积的组分定义在10%穿透（V10%）时上样的体积。对于人IgG，由280nm的紫外曲线测定V10%。根据方程1计算10%穿透时的动态结合载量。DBC10%=(V10%-V0)C0/Vc[1]其中C0=抗体浓度（mg/ml），Vc=几何总体积（ml），V0=空体积（ml）。工艺经济性分析当处理逐渐增加的更高表达量物料时测定生产力（g/l/h）。用于显示一种层析介质的生产优势的纯化潜力（Ppotential）定义为给定数量的层析介质整个寿命中可以处理的抗体的量。可以通过一定体积的层析介质和通过相同体积可以处理的批次数从每批纯化的抗体产量计算。如方程2所示。纯化每批要纯化的量（kg）Nlife†潜力，Ppotential=层析柱体积（ml）N循环数/批次每体积所使用的通过给定体层析介质要纯化的积的层析介质可以抗体的量处理的批次数†Nlife=层析介质寿命经过纯化潜力分析评估生产中的层析介质利用率以及相关参数。结果与讨论动态结合载量对停留时间表1显示对于MabSelectSuReLX针对单克隆IgG1和人IgG在10%穿透（DBC，10%穿透）时在1和10分钟停留时间之间测定的DBC结果（图1）。表1.在MabSelectSuReLX上对于人IgG和单克隆IgG1对停留时间的DBC停留时间(分钟)DBC,10%穿透(mg/ml)人IgG单克隆IgG1118.32.437.139660.563867.71069.268人IgG单克隆IgG1停留时间(min)图1.DBC作为停留时间的函数增加。比较两种层析介质的相关数据（图2）显示，它们的DBC在短停留时间几乎相等（≤3分钟），但MabSelectSuReLX在较长停留时间显示比MabSelectSuRe明显更高的DBDBC,10%穿透(mg/ml)停留时间(min)图2.人IgG对停留时间的DBC。MabSelectSuReLX在较长停留时间具有更高的DBC。单克隆抗体浓度对DBC和停留时间利用澄清的CHO细胞培养液在三个不同的单克隆抗体浓度测定MabSelectSuReLX的10%穿透DBC。停留时间在2.4和10分钟之间变化。结果如表2和图3所示。正如预期，DBC随着停留时间的增加而增加，但在澄清的CHO细胞培养液上清中的单克隆抗体浓度对DBC没有仸何显著影响。表2.MabSelectSuReLX在三个不同的停留时间和三个单克隆抗体浓度的DBC。停留时间(min)DBC,10%穿透（mg/ml）1g/lMAB5g/lMAB10g/lMAB2.4393940663616210686969停留时间(min)图3.单克隆抗体浓度对10%穿透DBC和停留时间。不同的浓度没有明显影响MabSelectSuReLX的DBC。不同抗体的动态能力在6分钟停留时间对七种不同单克隆抗体测定MabSelectSuReLX和MabSelectSuRe的10%穿透的DBC。表3和图4显示了结果。可以看出，对于MabSelectSuReLX，DBC高出20%到46%。表3.对于七种不同单克隆抗体在三个停留时间的10%穿透DBC图4.在6分钟停留时间，与MabSelectSuReLX与MabSelectSuRe相比具有明显提高的DBC。生产力分析源于其特殊的结合载量而在通量和稳定性上的收获，再加上公认的高流速琼脂糖机械稳定性，意味着MabSelectSuReLX能够在各种流速和上样量下捕获单克隆抗体。与MabSelectSuRe相比，这转化为更好的工艺生产力。DBC,10%穿透(mg/ml)DBC,10%穿透(mg/ml)DBC,10%穿透(mg/ml)图5显示在处理逐渐提高的较高表达量CHO细胞培养液上清（1、5和10g/l）时测定两种层析介质的生产力（g蛋白/l层析介质/h）的结果。当使用MabSelectSuReLX以确保层析介质全部结合载量的最佳使用的上样流速处理大量抗体时取得最高的收益。1g/l物料表达量线性上样速度（cm/h）5g/l物料表达量线性上样速度（cm/h）10g/l物料表达量线性上样速度（cm/h）MabSelectSuReLX等价MabSelectSuRe最大生产力性能最大生产力图5.等高线图显示了MabSelectSuReLX和MabSelectSuRe在不同的柱床高度和上样速度下MabSelectSuReLX和MabSelectSuRe之间的生产力差别（ΔProd，g蛋白/l层析介质/h）。最大线性上样速度被柱压降范围限制，如虚线所示。不包括上样的所有层析柱循环操作在最大流速下运行，如压降限制所测定。生产中的层析介质利用MabSelectSuReLX的高结合载量允许大量样品被上样到层析柱上。这可以减少处理时间和/或当工艺被放大时允许使用当前的层析柱和硬件，而不用投资新的设备。整合纯化工艺到现有设备也应该更简单。在某些情况下，可以减少处理给定量的抗体所需要的层析介质体积。在高通量、大规模单克隆抗体生产环境中，使用MabSelectSuReLX进行内部优化计算以鉴定性能收益，与MabSelectSuRe进行比较。目的是在8小时工作班次中处理10000升的高表达量发酵液。表4显示了结果。根据纯化大多数抗体所需要的层析介质量和循环数的伴随减少，MabSelectSuReLX的性能优点十分明显。此外，这些减少也降低了纯化步骤的整体缓冲液消耗。表4.用于在MabSelectSuReLX和MabSelectSuRe上处理一批50kg抗体的优化工艺的分析数据所选择的输入参数设置值批次体积（l）10000上样浓度（g/l）5每天的总上样量（kg）50最大批次处理时间（h）8每轮上样在10%DBC时的80%穿透能力所选择的输入参数优化后的值MabSelectSuReLXMabSelectSuRe层析柱直径(cm)140160床高度(cm)1613循环数，N循环数/批次56处理时间(h)7.87.9层析柱体积CV(l)246261线性上样速度(cm/h)227254最大线性流速(cm/h)639792每轮上样量(g/l)4132生产力(g蛋白/l层析介质/h)25.924.1总缓冲液消耗(l)2458131329注释：工艺设定含有层析柱平衡（3CV）、上样、两个上样后洗涤步骤（3CV和2CV）、洗脱（4CV）、再生（3CV）和CIP。在固定的3分钟停留时间运行平衡、上样后洗涤、洗脱和再生。在每轮操作后假定层析柱的CIP有15分钟的接触时间。428-9875-25AA床高（cm）床高（cm）床高（cm）表5显示了应用到表4中所述的情况的一种纯化潜力分析的结果。假定两种层析介质的寿命（Nlife）相等，则MabSelectSuReLX在它的寿命中将能够比MabSelectSuRe多纯化大约30%以上量的抗体（1）。在许多情况下，MabSelectSuReLX与MabSelectSuRe相比展示更长的寿命。检查利用0.5MNaOH的反复在位清洗（CIP）对DBC影响的寿命性能研究的数据显示，MabSelectSuReLX与MabSelectSuRe相比在相同次数的CIP循环后保留了更大的DBC百分比（1）。例如，长20%的寿命加上高30%的上样量将在它的整个寿命周期导致每升大于50%以上的纯化抗体。表5.当纯化一批50kg抗体时，根据表4所述的结果的生产效率分析参数输出值MabSelectSuReLXMabSelectSuRe每批要纯化的抗体的量(kg)5050所需要的层析介质体积，CV(l)246261循环数，N循环数/批次56层析介质寿命，Nlife(循环)200200纯化潜力，P潜力(kg/l层析介质)8.136.39结论正如预期，DBC随着停留时间增加而增加，但是在澄清的CHO细胞培养液上清中的单克隆抗体浓度对DBC没有仸何显著影响。在6分钟停留时间，MabSelectSuReLX比MabSelectSuRe提供≥20%的DBC，而在低于3分钟的停留时间下，它们的结合载量几乎相等。由于增加了大约20%的寿命，MabSelec