细胞系和细胞株的建立

Chapter4AnimalCellCulture◆Biologyofcellsinculture◆Fluidforcellculture◆Standardcellculturetechniques◆Establishingacelllineorcellstrain◆Cellfreezingandrecovery◆AnimalCellEngineering◆Section5：细胞系和细胞株的建立一、肿瘤细胞的体外培养与建系过程以人上皮型鼻咽癌CNE-2细胞系的建立为例问题：具体的建系过程应该包括？1.取材用鼻咽活检钳从一鼻咽癌患者的鼻咽部肿物获得组织块。2.原代培养1）鼻咽部肿物组织放入含青霉素和链霉素的RPMI1640培养液内，于4℃下静置2小时。2）然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含青霉素和链霉素的RPMI1640培养液洗涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中。3）37℃、CO2培养箱内培养2小时后，再补加含20%的小牛血清的RPMI1640培养液，继续培养。3.建系过程■组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可以见到成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加快，并向周围延伸。■用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长，命名为CNE-2。CNE-2经生物学特性分析后确定细胞系建立成功克隆细胞株通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的稳定的、具有特殊性质或标志的培养物。稳定的特殊标记，如：染色体组型，特殊的染色体标志或特定的同功酶谱。特殊性质，如：一定的生化特性，温度敏感突变株二、细胞株的建立过程1.细胞克隆技术(p59)培育细胞株可采用细胞克隆技术。一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来，分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法称为克隆化(cloning)。2.细胞克隆培养的技术方法◆稀释铺板法◆饲养层克隆法◆胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法◆琼脂克隆法◆毛细管单细胞克隆法饲养层克隆法饲养细胞：一层经过特殊处理的用做克隆细胞底物的细胞层。制备过程过程如下：饲细胞层克隆法琼脂克隆培养3.影响克隆形成率的因素◆接种细胞的密度◆培养基、血清◆饲养细胞◆激素和生长因子◆CO2、适应性生长基质原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂。因此在培养初期，存活和生长的细胞类型也是多种多样的。所以再培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长，而且是使培养物逐步成为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细胞系(或株)。三、细胞系（或株）的鉴定1.细胞系鉴定指标当细胞系建立后，应对细胞系进行一系列鉴定后，才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等方面的研究。鉴定内容应包括:1)细胞系的细胞来源；2)细胞系的纯度，即除了主类细胞外，还杂有哪类细胞；3)细胞系的稳定性，即细胞连续培养过程中主要指标应无明显变化；4)累积细胞系的形态及其表达特征的基本数据，以及其与来源细胞的差异等2.细胞系的鉴定方法1）形态学：活细胞观察；固定染色观察培养细胞。2）染色体：染色体是一种鉴定细胞系的种属、性别来源较为确切的指标；也是检查细胞系是否趋于稳定，在离体培养条件下细胞有否发生转化的可靠指标；是区别正常细胞与恶性细胞的指标。采用染色体数目、核型分析以及染色体分带技术检测。3）同工酶谱：通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、LDH(乳酸脱氢酶)、核苷磷酸化酶三种方法，根据条件选择。4）细胞DNA遗传特征:限制性片断长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphismRFLP)是指那些在生物进化过程中，DNA序列发生某些中性突变，突变的结果是失去或获得一个酶切点，因此当基因组DNA用限制性内切酶酶切后，限制性内切酶片断加长或缩短；用同源的克隆DNA为探针可以探测出来。另外也可能在生物进化过程中DNA分子结构发生重排，使DNA碱基排列序列改变，影响内切酶切点,使内切酶酶切片断呈多态性。一般采用Southern印迹杂交法检测。细胞转化及恶性程度检查•一般利用软琼脂培养法检测四、档案资料的建立及其管理◆细胞系（或株）的建立者◆组织来源◆细胞学性状◆培养条件和方法◆冻存液等建立细胞株（系）的要求•组织起源和已经传代的代数•冻存液•细胞活力•培养液：培养基、血清和抗生素•融解后细胞生长特性•接种存活率•细胞形态•核型•无菌检测：细菌、真菌等•物种检测：检测同工酶谱•反转录酶检测•细胞建立者•检测者•以美国ATCC细胞库的标准，必须有以下的鉴定数据，才能入库。细胞系或细胞株的命名HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（NationalInstituteofHealth）建立；每3天传代，每次接种3×105细胞／毫升。