gfp基因的克隆与表达

基因工程实验设计题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达专业：生工1001姓名：刘会淼2013年3月13实验目的：研究绿色荧光蛋白（GreedFluorescentProtein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。实验方法;通过分别将DH-5α(pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coliDH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶NotI与BamH1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后,通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。1.材料与方法：1.1.1实验材料克隆菌E.coliDH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶BamH1、NotⅠ1.1.2仪器设备Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管1.1.3试剂及溶液分装后于121℃高压灭菌20min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1%）；溶液Ⅰ50mL葡萄糖50mmol/LTris-Cl(pH8.0)25mmol/LEDTA(pH8.0)10mmol/L121℃高压灭菌15min后置于0~4℃贮存；溶液Ⅱ100mLNaOH0.2mol/LSDS1%(W/V)用时由母液2mol/LNaOH、10%(W/V)SDS稀释现配；溶液Ⅲ100mLKOAc(5mol/L)60mL冰乙酸11.5mLH2O28.5mL121℃高压灭菌15min后置于0~4℃贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10×酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲。灭菌的0.1mol/LCaCl2，标准相对分子质量的DNA；溴乙锭（EB）储存液0.5µg/mL；LB/Kan（50µg/mL）固体培养基；IPTG配成浓度为400mM水溶液，-20℃保存备用；卡那霉素（Kan）配成浓度为100ug/mL水溶液，-20℃保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在0~4℃；无水乙醇：放在0~4℃；RNase母液：将RNase溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl配成的试剂中，配成10mg/mL的溶液，在100℃加热15min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃；1.2方法：1.2.1大肠杆菌DH-5α(pEGFP-N3)染色体DNA的提取1.2.2、实验目的：掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。1.2.3，器材：⑴，微量移液器、高速离心机、1.5mlＥＰ管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱⑵，消化缓冲液:CTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O,缓慢加入10gCTAB,加水至100ml；其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70%乙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K(20mg/ml或粉剂)，5mol/LNaCl。1.2.4实验原理生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。1.2.5、实验步骤1.100ml细菌过夜培养液,5000rpm离心10分钟,去上清液。2.加9.5mlTE悬浮沉淀,并加0.5ml10%SDS,50μl20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K,混匀,37℃保温1小时。3.加1.5ml5mol/LNaCl,混匀。4.加1.5mlCTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20分钟。5.用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心10分钟,将上清液移至干净离心管。6.用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干净管中。7、加1/10体积3mol/LNaAc，及２.５倍体积预冷（－２０℃）无水乙醇，混匀。－２０℃沉淀３０min。12000rpm15min，弃上清8、加70%乙醇1ml，轻轻混匀，12000rpm15min，弃上清。9、ＥＰ管放置于烘箱中烘干。10、加３０ulTE或ddH2O溶解ＤＮＡ。11、琼脂糖凝胶电泳检测注意，实验室中一般用的1.5ml的EP管，可根据自己需要按比例调节加样量。DH-5α(pET-28a)的载体质粒也可根据同样方法提取。1.3.1ＰＣＲ扩增1.3.2实验目的１、学习ＰＣＲ扩增的基本原理。２、掌握ＰＣＲ技术的常规操作。３、了解ＰＣＲ扩增的参数设计。1.3.3实验原理１、聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段的过程。２、ＰＣＲ反应体系引物、dNTP、Mg２＋、模板、TaqDNA聚合酶，Buffer。３、ＰＣＲ循环参数①9５℃5min②9５℃30s③5２℃30s④72℃30s⑤goto②２９times⑥72℃10min1.3.4器材1，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统2，TaqDNA聚合酶，PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液3，引物：1.3.5实验步骤１、在0.2mlPCR微量离心管中配制30ul反应体系。ddwater10.5ul10×PCRbuffer（不含MgCl2）3ul25mMMgCl22ul10mmol/LdNTP1ul10μmol/L引物11ul10μmol/L引物21ul模板1ulTaq酶0.5ul总体积20ul２、在离心机中混匀。３、ＥＰ管放入ＰＣＲ仪中，按照原理中的条件设置程序，进行ＰＣＲ反应。４、PCR结束后，取3ulPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测1.4凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接1.4.1、实验目的1.学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。2.掌握DNA体外连接的方法。1.4.2，实验原理1，DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关：DNA分子大小DNA分子构象琼脂糖凝胶浓度电泳所用电压电泳缓冲液2.利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。3.Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3’端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。1.4.3，仪器1，凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯，1.5mlEP管，1.5mlEP管架，65℃水浴锅2，PCR产物，1×TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000marker1.4.4，实验步骤1，2%琼脂糖凝胶电泳2，在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量3，加入5个凝胶体积量的DR-ⅠBuffer4，混匀65℃加热融化凝胶块5，加入DR-ⅠBuffer量的1/2体积的DR-ⅡBuffer,当目的片段小于400bp再加入终浓度为20%的异丙醇6，将上述溶液short后转移至spincoloumn中12000rpm,1min弃滤液7，加入500ulRinseA12000rpm30s弃滤液8，加入700ulRinseB12000rpm30s弃滤液9，同810，将spincoloumn安置于新的1.5mlEP管中在spincoloumn膜中央加25ulElutionBuffer放入烘箱1min12000rpm1min保存1.5mlEP管1%胶检测11，链接反应（冰上操作）在一支0.2mlEP管中加入以下试剂：纯化的目的DNA片段4.5ulVector0.5ul连接液5ul混匀16℃连接过夜1.5DH-5α和BL-21感受态细胞的制备1)将0~4℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37℃下250r/min过夜培养16h。2)将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2mL的LB液体培养基中，37℃活化培养2～3h至OD=0.3～0.5。3)取1.5mL菌液转入EP管中，置于冰上10min,然后于4℃下5000r/min离心5min。弃上清液，沉淀加入0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30min后，4℃下5000r/min离心10min。4)弃上清液，沉淀用0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20℃冰箱内保存。1.6感受态细胞的转化1)取制备好的感受态细胞100μl，冰上解冻，均匀悬浮。2)加入2μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30min。3)42℃水浴中热击70sec后，冰上放置2min。4)加入200μlLB液体培养基，37℃，50-100rpm振荡培养1h。5)取200μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2h后，封口膜封好平皿，37℃培养倒置12-16h。1.7碱法提质粒1)用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2mL含有抗生素的LB液体培养基中，37℃,180r/min振荡培养过夜。2)取1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃、11000r/min离心1分钟，吸弃上清。3)向离心管中加入150l用冰预冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重悬沉淀。4)加入200l新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。5)加入150l用冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻混匀，冰上放置3~5分钟。6)用微量离心机于4℃、11000r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。7)加等体积氯仿400l抽提，振荡混匀，用微量离心机于4℃、11000rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。8)吸取上清液300l，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4℃、11000rpm离心5分钟，弃上清。9)用70%乙醇洗涤2次，再次4℃、11000rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。向已干燥的离心管内加20l超纯水溶解质粒DNA，加入2l10mg/mlRNA酶，37℃处理1小时后于-20℃贮存。1.8酶切鉴定1)取提取的质粒8l于另一微量离心管中，加入2lBamHI和NotI的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。2)离心，使溶液聚集在管底部。3)37℃，酶切反应。1.9琼脂糖凝胶电泳1)称取0.8g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100mL1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60℃左右。2)轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。3)将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。4)吸取10l的质粒与2l的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔。5)接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100V,I=30mA。6)当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。7)在凝胶成像分析系统中观察结果。2.0PCR-聚合酶链式反应1)将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分PCR反应体系各成分的量模板DNA0