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SOP操作细胞间SOP操作所有操作人员必须在操作仪器前认真阅读此规程，使用时严格按照此规程步骤操作，首次使用者必须与该仪器主管人员联系。仪器设备使用规范一、玻璃仪器清洗，灭菌操作1.第一次使用的玻璃仪器必须先用洗衣粉超声洗涤20min，用自来水清洗20遍后使用洗液润湿内壁24小时，然后用自来水清洗20遍，用milli-Q水清洗10遍，milli-Q水浸泡24hr，烘箱烘干后，120℃，20min灭菌，灭菌后，于细胞间里层晾干后才能使用。[1]2.每次使用后，一定用自来水将管内的细胞用液残留冲洗干净后，置于洗衣粉或洗涤灵的水中浸泡超声洗涤20min。若未出现污染，第二次使用的玻璃仪器则采用洗液润湿内壁3小时，然后自来水清洗20遍，milli-Q水清洗10遍，烘干灭菌同第一次使用操作。若出现大规模污染，则采用第一次使用时的处理操作。[2]二、灭菌锅的使用1.每次使用前，注意锅内水位是否达到标准，（详细标准参见说明书）。检察锅内的水是否洁净。一般一周以上必须更换。[3]2.使用后，取出灭菌器材后，一定擦净锅内壁水珠，而且，用75%酒精进行擦洗。三、超净台面清洁1.超净台在使用前，一定保证紫外灭菌达到30min以上。关闭紫外灯，然后打开风扇，5min后开启日光灯，用75%酒精喷洗台面，点燃酒精灯。[4]2.使用完毕后，尽量移出可以不放置在超净台内部的物品，转移至相关地方，用75%酒精擦洗台面，打开紫外灯灭菌。离开操作室后，打开操作室紫外灯进行灭菌。四、培养箱操作1.培养箱正常工作后，要保证CO2浓度在5%，温度在37℃，箱内水盘中不能断水。CO2气瓶减压阀上指针不超过第二个小格。[5]2.每次开启培养箱，需用75%酒精喷洗双手，取出细胞培养瓶后，立即旋紧瓶塞。每次放入细胞培养瓶时，需要用75%酒精喷洗瓶口，在轻轻旋松，再放入培养箱中。3.若出现大规模污染，则需对箱内进行彻底消毒。采用方式为，先断去培养箱电源和CO2气源，撤去水盘，再用37%甲醛溶液喷洗箱内，密闭24小时，完成后，敞开箱门，打开空调换气24小时。不严重时，用75%的酒精喷洗，硫酸铜和高锰酸钾溶液清洗，再洗净盐溶液，用75%酒精喷洗。与此同时，打开超净台和操作室的紫外灯，进行室内灭菌。[6]五、工作服工作服不得离开操作室，只有实验时才使用，平时用紫外灭菌。SOP操作细胞用液一、培养基培养基的配置按照商品要求即可，但最终必须调节pH值在7.3~7.4之间。然后，过滤除菌，分装。4℃保存。[7]二、血清血清商品买来后，采用每25mL一管，无菌分装。-20℃冻存。按照10%体积添加至培养基中。三、L-谷氨酰胺(M=146.15)按照浓度为200mmol/L，用不含血清培养基配制，过滤除菌，1mL每pv管，无菌分装，-20℃冻存。按照1：100添加至培养基中。[8]四、双抗溶液双抗为青霉素，和链霉素的混合物。浓度均为10mg/mL，用MilliQ超纯水配制，过滤除菌，同样按照1mL每pv管，无菌分装，-20℃冻存。按照1：100添加至培养基中。五、PBSPBS的配置按照配方配制。可采用过滤除菌和高温湿热灭菌（20min,120℃）。[9]PBS配方：1000mLNaCl8.00gKCl0.20gNa2HPO4·H2O1.56gKH2PO40.20gH2O1000mL六、胰蛋白酶溶液按照配方要求，过滤除菌。4℃保存。所用水为MilliQ超纯水。[10]胰蛋白酶配方10Х储备液（Tripsin，含EDTA）Tripsin（1∶250）5.0gEDTA四钠盐2.0gNaCl0.85gH2O1000mL1Х工作液100mL用量10Х储备液10mL5mLNaCl0.71g0.71gKCl0.04g0.04g葡萄糖0.10g0.10gNaHCO30.035g0.035g1%酚红0.1mL0.1mLH2O90mL95mL终浓度0.5%0.25%目前，实验室培养干细胞所用胰酶工作液浓度为0.25%SOP操作实验员操作一、实验员应在进缓冲间时换鞋。在细胞培养期间，除缓冲间专用鞋，其他鞋一律不得进入细胞间。二、实验员进入细胞间，应换上细胞操作室专用工作服，并戴上帽子，口罩，手套。三、关闭操作室紫外灯后，等待5min，待臭氧泯灭后，再进入操作室。进入后，应用75%酒精喷洗双手，喷洗超净台面，然后打开超净台风扇，打开日光灯，点燃酒精灯。四、不得用手触碰灭菌盒中的任何器具。应用超净台中的镊子夹取。五、任何已灭菌容器，打开瓶塞后，应将瓶口对准酒精灯火焰。旋紧时，必须先灼烧瓶口，然后对准酒精灯火焰，在酒精灯无菌区完成旋紧操作。六、任何外界容器，拿入超净台时，应用75%酒精喷洗瓶身，并用酒精灯灼烧瓶口，以及瓶口周围。七、完成实验后，应熄灭酒精灯，关闭风扇，并用75%酒精喷洗擦净超净台面，关闭玻璃门，打开紫外灯，灭菌。八、离开操作室之前，脱下工作服，放在操作室，不得穿出操作室。九、打开操作室紫外灯灭菌。注：[1]器具灭菌前必须烘干或在紫外灯下晾干，湿的灭菌效果不好。[2]每次使用后，一定用自来水将管内的细胞用液残留冲洗干净后，否则以后的清洗很困难。若未出现污染也没用作其它用途，可以不必每次都用洗液清洗。[3]严格按照灭菌锅操作安全进行。经常换水为了保证灭菌效果。[4]关闭紫外灯后要等5min再开启日光灯，否则细菌可能会见光自动修复。[5]压力过大会损坏培养箱的进气管。[6]培养箱不使用时必须把托盘里的水倒掉，否则滋生细菌。[7]培养基在储存过程中pH值会减小，所以初始配制时应略高一些。[8]血清中含有营养物质L-谷氨酰胺，但是半衰期大约2周，如果配好的含血清培养基2周内未用完，应补加适量L-谷氨酰胺。[9]可在PBS中加适量双抗以防PBS染菌，但一般情况下不是必须。[10]也可不配储备液，防止长期储存时出问题。