生物素标记蛋白操作方法

生物素标记蛋白操作方法下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。1、溶解2－10mg蛋白于1ml的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。2、在打开之前，平衡生物素至室温。加2mgSulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。（见下表）3、室温30分钟，或冰上放置2小时。4、用30mlPBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中。5、以280nm的吸收值测定蛋白含量。6、生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。HABA法检测生物素标记效果试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mMNaclPH7.2）②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mMHABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：1、吸取900ulHABA/亲和素溶液于1ml比色杯。2、测定该溶液在500nm处的吸收值并记录为“A500HABA/Avidin”。3、吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500HABA/Avidin/Biotin(数值必须恒定15s以上)如果A500HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。注：计算结果时必须考虑稀释度。4、计算Biotin/Protein摩尔比①A=生物素化的蛋白毫摩尔浓度＝蛋白浓度（mg/ml）/蛋白的分子量②B=500nm处的吸光度变化△A500=（0.9×A500HABA/Avidin）-A500HABA/Avidin/Biotin③C=生物素的毫摩尔浓度=mmolBiotin/ml反应溶液=△A500/（34,000×光程）④Biotin/Protein摩尔比=C·10·稀释倍数/A蛋白质蛋白分子量蛋白含量mg/ml溶液内所含的蛋白毫摩尔数需加入生物素的毫摩尔数生物素大约加入量需加入生物素溶液的体积IgG150,000106.7×10-58.0×10-40.4mg20ulIgG150,00021.3×10-52.7×10-40.15mg7ul