第六章临床生化诊断试剂盒的选择与评价临床生化诊断试剂盒的选择

1第六章第六章第六章第六章临床生化诊断试剂盒的选择与评价临床生化诊断试剂盒的选择与评价临床生化诊断试剂盒的选择与评价临床生化诊断试剂盒的选择与评价随着自动生化分析仪的研制成功和普遍使用，推动了体外诊断试剂商品化的进程，商品试剂与标准液按检测项目组合成一套放在一个包装盒内叫试剂盒（reagenkit），或叫试剂组合（reagenset）。与自动化分析仪匹配的试剂盒的研制、生产和供应走向产业化的道路，它无疑是临床生化发展史上一个巨大的技术进步。但是，试剂盒的质量，将严重影响测定结果的正确性。为了增强识别试剂质量的能力，提高拒用劣质试剂的自觉性，掌握有关试剂盒的质量标准和质量评价是十分有益的。第一第一第一第一节试剂盒的分类和特点节试剂盒的分类和特点节试剂盒的分类和特点节试剂盒的分类和特点临床生化诊断试剂种类繁多，有液体型、粉剂型、片剂型，有单一试剂、双试剂、干试剂、多试剂等。生产厂、供应商也很多。纵观近20多年来的发展，临床生化体外诊断试剂盒的分类和发展历史可用下图6-1表示。一一一一、、、、液体型试剂和粉液体型试剂和粉液体型试剂和粉液体型试剂和粉（（（（片片片片））））剂型试剂剂型试剂剂型试剂剂型试剂（（（（一一一一））））液体型试剂液体型试剂液体型试剂液体型试剂无论是单试剂还是双试剂型试剂，目前乃至今后仍以液体型为主要剂型。其优点是液体型试剂的试剂组分高度均一，瓶间差异小，测定重复性好和使用方便；它也无需加入任何辅助试剂及蒸馏水，避免了外源性水质对试剂的影响，性能较稳定，测定结果较为准确。缺点是液体型试剂（尤其是酶试剂）保存时间较短，不便于运输。1．液体单试剂所谓液体单试剂就是将某种生化检验项目所用到的试剂科学地混合在一起，组成为一种试剂。应用时，只须将标本和试剂按一定比例混合，即可进行相应的生化反应，然后用适当的方法检测结果。应用十分方便。为了简化测定操作程序，提高工作效率，一度大多数试剂厂家都生产单试剂，以满足用户的需要。如测定葡萄糖和胆固醇的酶法试剂等。这些试剂的广泛使用，图6-1临床生化诊断试剂盒分类和发展史2充分显示出酶法试剂无毒性、操作简便快速、测定结果可靠等优点。但对有些生化检验项目来说，单试剂存在抗干扰能力差的缺点，给测定结果带来相当大的分析误差。例如，甘油三酯测定的一步法试剂，由于未消除样品中的游离甘油，使测定结果中包括了内源性甘油（平均约为0.11mmol/L），会给甘油三酯的测定值带来较大的误差。类似的情况还见于维生素C和尿酸及胆红素对Trinder反应的干扰，内外源性NH4+对尿素酶法测定的干扰，以及内源性丙酮酸对ALT、AST测定的干扰等。选用时值得注意。2．液体双试剂所谓液体双试剂就是将某些生化检测项目所用到的试剂，按用途科学地分成两类，分别配成两种试剂，通常第一试剂加入后可起到全部或部分消除某些内源性干扰的作用，第二试剂为启动被检测物质反应的试剂，两种试剂混合后才共同完成被检项目的生化反应。然后用适当的方法检测结果。双试剂型试剂盒，它保持了单试剂的优点，增强了抗干扰能力和试剂的稳定性，提高了测定的准确性，代表了诊断试剂盒剂型研制的主要发展方向。（（（（二二二二））））粉粉粉粉（（（（片片片片））））剂型试剂剂型试剂剂型试剂剂型试剂所谓粉剂型及片剂型试剂，即是将试剂的各组分用球磨技术粉碎成粉剂或混合后压成片剂，使用前再加入指定的溶液复溶成液体试剂。干粉试剂如果在冻干分装前是液体型的，则其各组分是相当均匀的；但如果用固体原料研磨后制成粉剂或片剂，则存在许多问题：①要使试剂各组分混合得非常均匀，技术难度很大；②分装过程中的称量误差及复溶时加水量的准确性影响试剂的瓶间差；③水质优劣对试剂的稳定性和测定的可靠性有相当大的影响。二二二二、、、、其它类型试剂其它类型试剂其它类型试剂其它类型试剂为了适应生化分析仪和测定方法学的进步，近年来研究了许多新型的试剂盒，主要有以下几种。（（（（一一一一））））快速反应试剂盒快速反应试剂盒快速反应试剂盒快速反应试剂盒快速反应试剂盒主要是为了适应生化分析的技术进步，缩短反应时间，提高工作效率。如血液葡萄糖快速测定试剂盒。其试剂成分及浓度为磷酸盐缓冲液100mmol/L，pH7.4±0.1，葡萄糖氧化酶40u/ml，变旋酶0.2u/ml，过氧化物酶2.5u/ml，4-氨基安替比林0.5mmol/L，4-羟基苯甲酸4mmol/L，亚铁氰化钾1mg/L，叠氮钠0.4g/L。同一般葡萄糖氧化酶法试剂相比是明显增加了葡萄糖氧化酶及过氧化物酶用量，更主要是增加了变旋酶，可使反应加快，3～4分钟后即生成最终颜色。再如快速胆固醇试剂盒，用的是pH6.6±0.2，250mmol/L磷酸盐缓冲液，胆固醇酯酶为250u/L，胆固醇氧化酶250u/L，过氧化物酶4000u/L，4-氨基安替比林0.3mg/L，DHBS8mmol/L。样品与试剂比例是1:100。37℃反应2分钟即可完成反应。可以明显看出是加大胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶等效应酶用量，从而使反应加速。目前要求这种快速反应的试剂用户还不多，但它是一种发展趋势。3（（（（二二二二））））一步法试剂盒一步法试剂盒一步法试剂盒一步法试剂盒这是随着方法学的改进，特别是免疫技术的进步，利用特异性抗体参与反应的新型试剂。如高密度脂蛋白（HDL）测定。以往多采用超速离心法和沉淀法使HDL从其他脂蛋白中分离后再测定HDL中胆固醇，沉淀法操作繁琐，必须预先处理才能用生化分析仪分析。近年来采用抗低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白血清预先抑制LDL及VLDL，然后再测定HDL，这样就减少沉淀预处理，直接测定出高密度胆固醇。类似的试剂盒还有肌酸激酶（CK）及其同工酶CK-MB的测定。（（（（三三三三））））多项同测组合试剂盒多项同测组合试剂盒多项同测组合试剂盒多项同测组合试剂盒这类型试剂主要是用于三点双项同测终点法、三点双项同测连续监测法和三点双项同测终点速率法测定的试剂盒。很明显这类试剂同以往单试剂和双试剂有明显不同。随着双试剂的应用，临床生化分析仪的分析方法也相应发展，其中有一种分析方法是在同一比色杯中，先后加入两种试剂与检品中的两种被检物发生反应，在各反应达到平衡期时分别测定，整个测定过程进行三次比色，测定两个项目，称为三点双项同测终点法。例如甘油三脂、胆固醇同时测定法。该法的第一试剂为Tris缓冲液，含胆固醇酯酶、ATP、MgCl2、过氧化物酶、磷酸甘油氧化酶、甘油激酶、脂肪酶、4-氨基安替吡啉、2-羟3.5-氯苯磺酸钠、Triton-X等，第二试剂为Tris缓冲液，其中含胆固醇氧化酶。当血清或标准液（包括甘油三酯和胆固醇）与第一试剂混合后立即进行第一次比色（510nm）得空白吸光度。37℃作用5分钟后进行第二次比色，为甘油三酯与酶试剂反应终点的吸光度，又是胆固醇测定的空白吸光度。然后加入第二试剂，37℃作用5～10分钟，进行第三次比色，为胆固醇与酶试剂反应终点的吸光度。甘油三酯浓度=[A2（样品）-AB（样品）]/[A2（TG标准）-AB（TG标准）]×甘油三酯标准的浓度总胆固醇浓度=[A3（样品）-A2（样品）]/[A3（TC标准）-A2（TC标准）]×胆固醇标准的浓度（（（（四四四四））））卡式试剂盒卡式试剂盒卡式试剂盒卡式试剂盒试剂首先装入试剂瓶，瓶上充分使用编码技术，而后根据编码启动调配、使用及更换储存。其特点是：①卡式试剂瓶上条码令使用者可快捷准确地输入试剂数据，如测试数量、批号、有效期，保证正确识别试剂。②试剂装载后能自动调配，可消除潜在误差，并节省操作时间。③持续不断地监察仪器上已装载的试剂存量，并在供应量不足时通知使用者。试剂装载使用时间可长达一个月。④所有卡式试剂盒大小划一，有利储存。卡式试剂设计较独特，可防止试剂蒸发及降解，能确保试剂装载后的稳定性更长，从而节省成本。⑤标签根据测试类别以颜色编码，便于使用者识别。（（（（五五五五））））浓缩试剂盒浓缩试剂盒浓缩试剂盒浓缩试剂盒上述卡式试剂盒就是采用的浓缩试剂，使用时自动完成稀释，而后用于测定。浓缩试剂便于工作、储存、运输、装载等优越性是很明显的，浓缩试剂便于监控、减少校正次数、提高工作质量。在浓缩试剂基础上又组成双试剂及多项同测组合试剂，又体现出它们所具有的特点及优越性。以后4这种浓缩试剂及其各种组合，将成为一种时尚，将成为人们乐于使用的新型试剂盒。三三三三、、、、液体双试剂盒的特点液体双试剂盒的特点液体双试剂盒的特点液体双试剂盒的特点液体双试剂与其它类型试剂比较具有液体试剂和双试剂的优点。（（（（一一一一））））提高了抗干扰反应的能力提高了抗干扰反应的能力提高了抗干扰反应的能力提高了抗干扰反应的能力在临床生化测定过程中，血标本除了含有待测物质外，还含有各种酶、有机物、无机盐等物质，这些物质都会干扰或参与测试反应，引起非特异性反应干扰，而双试剂型试剂盒设计的一个主要目的就是为了克服这种干扰反应。在测定过程中，首先让试剂Ⅰ与标本中的干扰物质反应，反应5分钟后，再用试剂Ⅱ启动真正的测试反应，从而使测定结果更加准确。例如：尿素氮的酶法测定。此测定通过二步化学反应来完成。242CONHOH+──→─+脲酶尿素2GLDH4CONADNADHNH++───→─+-α++谷氨酸酮戊二酸在340nm下监测吸光度值的变化，与同样处理的尿素标准液比较，计算出样品尿素含量。这一反应的第一步特异性高，脲酶只对样品中的尿素起催化作用，但第二步反应就存在一些干扰：样品中（如血清、尿液）含有NH4，（内源性NH4）会消耗NADH，使测定结果偏高；复溶试剂时所用蒸馏水如果含有NH4或者所用器材不够清洁被NH4污染（外源性NH4）也会消耗NADH，使测定结果偏高；当样品中（如血清）含有较高的丙酮酸时，血清中的乳酸脱氢酶会催化下列反应：OHNADHNADH2LDH++──→─+++乳酸丙酮酸也会消耗NADH，使测定结果偏高。也就是说，用单一试剂型试剂测定尿素时存在内源性NH4、外源性NH4和内源性丙酮酸的干扰，使测定结果产生正误差。测定尿素的酶法双试剂（液体型）试剂盒有两个试剂，均为液体，不必复溶。第一试剂含α—酮戊二酸、NADH、谷氨酸脱氢酶及维持pH的缓冲物质。第二试剂含脲酶、NADH、α—酮戊二酸。当被检样品加入第一试剂在37℃作用5分钟，将内源NH4、外源性NH4及内源性丙酮酸消耗掉。接着加入第二试剂使样品中的尿素被脲酶水解成NH4，再进行第二步反应，2GLDH4CONADNADHNH++───→─+-α++谷氨酸酮戊二酸，消耗NADH量与尿素量成正比，这就保证了尿素测定的准确性。再如：目前在临床化学检测中用的较为普遍的指示反应Trinder反应（主要用于代谢产物的测定，如葡萄糖、尿酸、甘油三脂、胆固醇、HDL），此指示反应的特异性较差，受到血标本中的胆红素、抗坏血酸的干扰，导致结果的阴性偏差。其中为了克服胆红素的干扰，国内外部分试剂已通过加入铁氰化钾、调整显色剂改变测定波长来排除胆红素的干扰，而抗坏血酸的影响和干扰一直较难克服，从面影响了测定结果。液体双试剂（包括甘油三脂、胆固醇、HDL、尿酸、肌酐）在试剂I中加入了抗坏血酸氧化酶，当标本和试剂I先反应，便可克服标本抗坏血酸的干扰，当抗干扰反应完毕后，再加入试剂Ⅱ启动反应，从而使得整个反应的特异性大大提高，准确度也相应提高。5另外，最常见的干扰是黄疸。有的测定试剂中加有胆红素氧化酶，先作用黄疸血清使其氧化无色，而后再加反应试剂完成反应测定，消除黄疸的影响。（（（（二二二二））））使测定更科学合理使测定更科学合理使测定更科学合理使测定更科学合理由于液体双试剂的使用，使测定更加科学合理。如游离脂肪酸甘油甘油三脂+──→─LP磷酸甘油甘油--──→─+3ATPGK22GPO2OHO3+──→─+--磷酸二羟丙酮磷酸甘油OHDHBSAAP4OH2POD22+──→─+-+醌亚胺目前国内临床生化检验使用的生化试剂绝大多数都是单一试剂，在甘油三脂测定中测得甘油三脂的含量实际上是标本中甘油三脂与游离甘油的总含量，尽管临床上可以通过减去标本中平均游离甘油的含量和修