第十六章基因诊断

第十六章基因诊断第一节概述一、什么是基因诊断所谓基因诊断，就是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断，它包括产前诊断，是一种新的临床诊断方法。是以DNA和RNA为诊断材料，利用分子生物学技术，通过检查基因的结构或表型来诊断疾病的方法和过程；其临床意义在于能检测DNA或RNA的结构变动与否，量的多少及表达情况等，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊或进行基因治疗的依据。二、基因诊断的概念界定以下6个方面内容：（一）诊断水平基因水平（二）诊断技术从方法学来说，没有特殊的基因诊断方法，就是分子生物学技术在临床上的应用。（三）诊断材料DNA和RNA。（四）诊断内容1、对于内源性基因来说：基因结构和表达是否异常。2、对于外源性基因来说：入侵基因的种类，是病毒核酸、细菌质粒还是寄生虫DNA.（五）诊断途径1、直接检查基因结构是否存在：DNA点突变、缺失插入、基因重排、染色体畸变、mRNA剪接缺失错位或结构变化等。2、检查基因转录产物mRNA：1）已经转录还是没有转录？2）应该转录还是不应该转录？3）转录正常、过量还是过少？3、检查基因表型：正常还是异常，进行分析研究。（六）诊断目的1、确诊相应疾病或得出相应结论。2、是防治疾病或基因治疗的根据。三、基因诊断的思路（一）基因是随便能诊断的吗？总不能乱诊断吧？（二）基因诊断和传统的疾病诊断方法有什么区别和联系？（三）基因诊断的理论基础和技术能不能诊断诊断学基础怎样诊断？为此，作下述讨论。希望对大家有所帮助。四、基因诊断方法和传统的疾病诊断方法表1表型诊断（传统方法）基因诊断（一）诊断依据疾病表型变化基因结构异常和表达异常（二）分类临床诊断（病因、病解、病生）DNA诊断血清学诊断RNA诊断生化学诊断（三）特异性表型改变在很多情况下是非特以探测基因为目标，只要异性的，往往难以明确诊断，有特异性探针，利用分子延误病情如FOU?杂交原理即可诊断，具有很高的特异性。（四）敏感性探针可用“放标”或“非放诊断灵敏度高，标本只需微量，DNApg水平即可。（五）早期诊断因为表型改变往往出现较晚，在表型改变之前，基因难以早期诊断结构或表达已发生改变，故往往可以早期诊断。（六）基因诊断范围广因为：①探针可为任何来源和种类，序列可为已知或未知，目标可为特定基因或特定基因组合，外源性或内源性基因，所以适应性强，诊断范围广。②被检查基因是否处于活化状态并不重要，故可对分化阶段表达特异性基因及其异常进行检测和诊断，这对肿瘤（如CML）疗效及预后尤为重要。③在感染性疾病的诊断，能检查正在生长或潜伏病原体，能明确既往感染或现行感染，对不易诊断（如产毒性E.coli）和不能安全培养（如立克次体）进行基因诊断，扩大了实验室诊断范围。（七）二者关系1.基因诊断必须建立在临床一般检查的基础上，它必须是临床检查的第二步或第三步手段。（不是随便诊断）2.基因诊断是分子生物学和医学遗传学发展到今天人们的一种设想，现在逐步走向临床，变成现实。3.尽管实验研究和临床应用技术原理相同，但诊断对象是人的时候应该慎重！（不能乱诊断）4.同临床诊断一样，忌不独立思考，人云亦云（举例）。细胞膜细胞核DNAmRNA转录翻译（protein）临床表现基因诊断生化诊断血清学诊断临床诊断图一基因诊断与表型诊断（五）基因诊断与诊断学（一）诊断是用医学科学的方法对疾病的表现所作出的辩证逻辑的结论。诊断目的：为了防御疾病和进健康。（二）诊断学是论述诊断疾病的基本原则和方法的一门课程。其基本原则就是研究症状体征发生的基本规律和机理以及建立诊断的思维程序。基本诊断方法包括：询问病史、体检、实验室检查、以及其他检查如：心电图、超声检查、内窥镜、CT、核磁共振等等。（三）基因诊断是诊断学的续写，是诊断学的新篇章，从这个意义上来说：基因诊断遵循诊断学的基本原则；基因诊断的基础是医学基础，专业基础是医学分子生物学和医学遗传学，不同的是我们在基因水平上，学习和研究：基因解剖（结构）、基因生理（转录翻译等）、基因病解（结构异常），基因病生（表达异常），然后主要应用分子生物学技术手段进行基因诊断。（六）基因诊断的思维程序：第一套：逆向遗传学（reversegenetics）思维程序1.提取人类基因组（总）DNA；2.建立DNA文库（DNABANK）；3.克隆任一DNA片段作为探针。4.确立该探针在基因组中的位置；这种探针在基因组中的位置一旦被确定下来，就可以成为遗传标记（geneticmarker）.5.大量应用此类新的遗传标记(用染色体步移法或染色体跳跃法)建立各条染色体的连锁基因图谱，最终建立整个人类的基因图谱。6.筛选遗传病病人或疑有与基因有关的疾病的病人；7.克隆病变基因8.比较正常基因和异常基因的差别推测正常异常基因产物（蛋白质）在细胞中定位以及生理病理效应。第二套拿来主义1.您诊断/研究的疾病是否：与/有/知道1）基因有关；2）该基因的正常/异常序列；3）该基因结构/表达异常的类型；4）特异性探针/PCR引物；5）转录物；6）表达产物/表达产物功能/表达产物功能测定方法。2.据1设计基因诊断方案。第二节基因诊断的分子生物学基础一、基因诊断的理论（一）生物大分子结构和功能（二）基因组结构和功能（三）遗传信息的复制和表达（四）基因表达的调控（五）细胞通讯与细胞信号转导的分子机制（六）癌基与抑癌基因（七）基因与疾病二、基因诊断的技术（一）核酸分子杂交，在这些方法中，1.Southern印迹法是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。2.Northern印迹法可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。3.斑点杂交可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。4.原位杂交可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原为杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。(二）聚合酶链式反应（PCR）PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中，PCR常与其它技术如分子杂交，限制酶酶谱分析，单链构象多态性检测，限制性片段长度多态性分析，DNA序列测定等联合应用。（三）单链构象多态性单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,sscp）检测是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与PCR联合应用，称为PCR—SSCP技术。（四）限制酶酶谱分析基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。（五）DNA序列测定DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位的突变的性质。（六）DNA芯片技术应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。三、基因诊断的内容（一）基因结构异常（基因突变检测）１、点突变1）已知的点突变2）未知的突变2、少数核首酸的缺失或插入3、大片段丢失或插入4、基因重排（染色体易位）5、基因扩增（二）基因表达异常（基因转录物探测）1、mRNA相对定量2、mRNA绝对定量3、mRNA长度分析（三）连锁分析（了解内容）1、限制性片段长度2、性家系连锁分析3、连锁不平衡（四）病原体的诊断入侵基因的种类四、基因诊断的途径（一）内源性基因诊断的途径主要有3种：即：基因突变的检测mRNA的探测连锁分析采取哪一条途径主要取决于：对致病基因及其分子病理学的了解程度；致病基因本身突变类型的复杂性。（二）外源基因的入侵的病原体的诊断1.入侵基因组DNA具有特异的DNA序列，以区别于别种生物体DNA序列。2.能把这种特异的DNA序列制成具有特定信号的探针。五、基因诊断的基本方法（一）点突变1、已知点突变PCR/ASO探针斑点（或缺缝）杂交法（1）据突变（位点序列：）a.设计一对引物，b.合成一对寡核苷酸探针（正常/突变序列杂合子）（2）提取患者基因组（总）DNA→PCR扩增（突变序列）DNA片段→（与ASO）斑点（或狭缝）杂交洗脱条件：完全配对（牢）不洗脱；不完全配对（不牢）易洗脱。（3）结果分析：①与正常探针杂交，而不和突变探针杂交表示受检者不存在这种基因；②只与突变探针杂交，说明突变基因是纯合子；③与正常/突变，探针都可杂交，说明突变基因是杂合子；④与正常/突变探针都不杂交说明不是已发现的突变。2、未知点突度SSCP—PAGE法、测序法提取DNA→DNA变性→SSCP—PAGE→测序确证（二）少数较苷酸缺失或插入的诊断方法可以用（一）的方法（五）基因扩增限制酶酶切待测基因的DNA或CDNA片段作为探针（位置改变）法光密度扫描（定量）。基因扩增→拷贝数增加（分子量）→电泳行为改变→杂交条带位置改变→与标准/正常对照定性/量扫描。（四）基因重排（染色体易位）多次/重PCR电泳分析、其前提是已知重排基因和重排位点的序列。（三）大片段丢失多次多重失PCR电泳分析设计引物使获得产物序列长短不同，有固定大小，据不同长短序列存在与否，检测是否有某些基因片段的缺失与突变（注意正常对照）。5′3′引物1引物3致病基因引物4引物25′3′引物1引物3（六）多态性分析1、RFLP（１）基本方法：①PCR产物酶切产物电泳分析。②基因连锁分析（PCR/RFLP连锁分析法）。人群个体核苷酸序列的差异性、称为DNA的多态性。由此影响限制酶切部位点而致RFLP（限制性片段长度多态性）。RFLP按照孟德尔方式遗传。故：①可检测人群中个体间存在的RFLP（限制酶酶谱分析）②遗传病的基因诊断（连锁分析）。如果一特定家庭（系）中，某一致病基因与特异性的多态性片段紧密连锁（连锁—是指同一条染色体上相邻近的基因一起被被遗传），就可以用这种多态性片段作为“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿基因组中是否携带有致病基因。对于某一限制酶来说：酶切位点在人群中存在共性（可能一样对核酶谱来说存在多态性（不一样）。（２）DNA多态性位点普遍存在整个人类基因组，估计每100个核苷酸便有一个发生突变，出现多态性。如果建立起一套以20CM间隔平均分布于整个基因的RFLP位点，选用合适的探针，理论上可以对所有的遗传病进行基因诊断。（3）关于基因连锁分析①多数遗传病诊断途径，因为：经基因突变检测途径，适用病种有限，原因是：a、致病的基因可在任何位点上产生突变，致使同一疾病有不同的突变类型。b、不少致病基因仅仅知道在哪一号染色体位置，尚未克隆出来，对其结构和分子机制毫无能知。c、有的致病基因尚未确定。②基因连锁分析必须具备的先决条件：a、家系中的关键成员（父母）为RFLP的杂合子，才能区分两条同源染色体。连锁遗传病只要母亲为某一RFLP的杂合子即可。b、子代存在患病的纯合子，这样才能确定致病基因与哪条染色体RFLP共同遗传。c、任何一种遗传病、单独使用一种RFLP、均有相当一部分父母染色体无法区分、所以要联用若干种RFLP及相当探针，提交诊断。d、待检亲代必须为生物学意义亲代。③连锁不平衡并不多见：指某一个多态性位点在基因和等位突变基因中的分布频率有显着差异。因此可用与特异等位基因连锁这一多态性进行基因诊断。如：正常人酶切图谱有9/9、22/9、22/22kb型，β-地贫纯合子只有9/9kb型（kan发现撕工岛人β-珠蛋白基因3’BamHI的多态性位点）故不经家系分析，仅以这一多态性即可用产前诊断。④RFLP连锁分析可能常是可靠的。连锁分析存在一定的错误原因是：a、人为差错。b、RFSP连锁分析方法本身的差错程度（方法本身局限性。）因为在减数分裂中间传染色体的某些区域可以发生重组和交换，从而使得原先共同遗传的DNA突变与RFLP发生分离，这样情况下作出连锁分析结果就会发生错误。诊断的错误率可以从DNA标志与疾病