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仁爱敬业创新奉献结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状与新进展邓建中•全球每年结核病新增900万例，每年有170万例结核病患者死亡•中国有超过450万例结核病患者，居世界第二•截止2011年，耐多药结核病已有31万例，全世界约有200万人潜伏感染并可能复发•诊断由是否为结核分枝杆菌上升到鉴别是否为耐药或潜伏感染的问题目前现状•结核性脑膜炎（TBM）是由结核分枝杆菌（Mtb）感染引起的非化脓性细菌性脑膜炎•在肺外结核中诊断难度、病死率、致死率均最高•同龄阶段结核病患者中儿童TBM占20-45%，成人只占2.9-5.9%•TBM早期临床表现、脑脊液变化、影像学均不典型，脑脊液收集有限，Mtb是细胞内寄生菌，故很多检测TBM的方法敏感度低、特异度不高、易误诊、漏诊。•目前，尚无一种方法可完全解决TBM诊断的问题1临床表现头痛、易激惹、呕吐、发热、颈项强直、癫痫、局部神经损害表现、意识改变、昏睡一、临床诊断2脑脊液约1/3不典型多数压力高，达200-400mmH2O无色透明，浑浊或出现薄膜已不常见；细胞数多在50-500×10-6/L,也可显著增高（＞1000×10-6/L）的患者脑脊液中可检测到抗酸杆菌分类：早期中性粒细胞明显增高，恢复期以淋巴为主蛋白含量多在1-3g/L60%以上葡萄糖低于正常3影像学检查无特征性，可为脑积水、脑梗死、脑膜增厚及脑结核瘤等多种形式头CT早期主要为渗出性，可见脑膜强化。后期主要为阻塞性脑积水头MRI，较CT敏感，尤其是波及脑膜或脑干时•分为直接病原学检查和间接病原学检查•最新国际TBM诊断标准：脑脊液中镜检到抗酸杆菌、分离培养到Mtb或PCR法检测到Mtb，可确诊•TBM患者脑脊液Mtb载量较低、敏感度明显低于颅外结核，尤其是肺结核二、病原学检查•直接涂片法•离心浓缩法•漂浮集菌涂片法1抗酸杆菌涂片、染色、镜检萋尼染色法（Ziehl-Neelsenstain)•传统方法、应用最普遍、敏感度低•只有脑脊液Mtb数量超过1000×10-6/L时才能检测到•改良抗酸染色法：通过玻片离心法保留细胞的完整性，在萋尼染色同时使用去垢剂Triton，提高细胞通透性，从而显著提高细胞内外Mtb检出率，敏感度更高•仅需0.5ml脑脊液，操作简便易行，•对形态多变、细胞壁部分或完全缺失的L型Mtb无法着色•不能区分Mtb和非Mtb发光二极管荧光显微镜（LED-FM）观察“0”-罗丹明染色•较普通显微镜放大2-4倍•不需油镜•可显著提高检测涂片时间，敏感度更高•WHO建议取代传统的萋尼染色法，是抗酸杆菌研究的发展方向•费用昂贵，目前只在发达国家普遍使用•诊断结核病的金标准•可鉴别Mtb和非Mtb、Mtb分型、药敏试验、药物研究Mtb培养1罗氏（Lownstein-Jenson)培养法应用最普遍，敏感度约20%，需时4-8周2MGIT（mycobateriagrowthindicatortube)液体960培养法近年研究新方法，敏感度约50%，平均14.4天，最快10天。操作简单、灵敏，全封闭非侵袭性检测系统防止交叉污染，是目前结核培养的主要发展方向通过连续检测接种标本培养基所显示的荧光强度变化来判断是否有分枝杆菌生长•检测Mtb特异核酸片段或抗原成分•有助于结核病诊断和对Mtb分型•快速、高效，可发展成为全自动化检测手段•目前诊断TBM领域发展最快的方向。三、病原学间接检查1聚合酶链反应（PCR）•多用于实验研究，非临床诊断•最新制定的TBM临床诊断标准将商业化的PCR检测试剂盒作为TBM诊断的金标准•成本高，敏感度低，尚未作为TBM的常规检查（一）核酸检测（1）经典PCR检测•选择性的扩增脑脊液中Mtb的DNA片段•常用的靶基因有IS6100保守片段、MPB64抗原、相对分子质量65000蛋白等•所需脑脊液量少，敏感度48-100%，特异度84-98%•各实验室所用的靶基因、引物、反应条件、报道的敏感度和特异度差异较大，因此，难以对TBM的诊断效率进行整体评估（2）GeneXpert:•通过对Mtb特有序列的rpob基因和利福平耐药相关81bp的核心区域进行检查，采用独特的定量PCR反应设计和全自动样品处理纯化核酸•敏感度92%，特异度99.6%，2小时可检测8个样本•操作安全，方法简便，样品使用量小•可用于脑脊液、胸腔积液、腹水、脓、粪便标本中的MTB检测•欧美国家已普遍受到认可（3）环介导等温扩增法•对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，使靶基因高效扩增，应用专门的浊度仪进行定时定量检测。•准确、简便、需时短、耗材少•敏感度88.23%，特异度80%•由于敏感度高，极易污染，会产生假阳性（4）线性探针技术•运用多重PCR扩增和和反向杂交技术，通过检测利福平和异烟肼耐药相关基因rpoB、katC、inhA的突变•敏感度94.3%，特异度96.0%•用于早期耐药结核病的诊断•操作复杂，费用昂贵，不易普及（5）基因芯片技术•将多种探针固定在玻璃等基片上，与待测样本的DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而进行大规模遗传差异分析•可用于结核菌种鉴定和Mtb耐药基因•诊断快速•标本中细菌数超过10000个才能呈现杂交阳性反应•敏感度低，特异度高将特异度高的DNA探针与敏感度高的PCR技术结合，是结核病研究和临床应用的一种良好途径（1）脑脊液结核抗原•不同种类的结核抗原纯度和活性差异很大，因此，检测效果差异较大•截至目前，人们使用过的结核抗原有20余种•卡介苗抗原和其他细菌有交叉反应，假阳性率较高2抗原检测•目前最常检测的结核抗原包括结核菌素纯蛋白衍生物、阿拉伯甘露聚糖（LAM）、早期分泌性抗原靶6（ESAT-6）蛋白抗原b、分泌蛋白MPT64、Mtb8.4、Mtb8、Mtb16.3、A60抗原、Ag85复合体、培养滤液蛋白10（CFP10等•检测方法：凝聚试验、酶联免疫吸附试验、免疫斑点法和免疫金标技术•对阿拉伯甘露聚糖（LAM）的检测已经进入临床诊断，有特异的LAM-IgG试剂盒，称作结明试验。操作简便，20分钟可出结果•不但可用来诊断TBM，还可以区分潜伏感染、现症感染、感染Mtb的毒力（2）胞内结核抗原•Mtb是胞内寄生菌•使用免疫细胞化学法检测脑脊液细胞内的结核特异性抗原与脑脊液循环结核抗原检测相比，敏感度可高达72.5-100.0%，特异度达90.7%（3）二维胶内差异凝胶电泳•已广泛应用于各种神经系统疾病•可鉴别出TBM脑脊液中表达的特异性蛋白•Mtb蛋白花生四烯酸-5-脂氧合酶（ALOX-5）、胶质纤维酸性蛋白、抗凝血酶Ⅲ可特异性升高，载脂蛋白E以及A-I、甲状腺素运载蛋白可特异性降低•ALOX-5可作为诊断TBM的标志性蛋白，如与质谱分析联合使用，可提高检出率1脑脊液结核抗体•血清中IgG抗体水平与病变程度呈正相关•检测血清中IgG抗体水平对于活动性疾病的诊断有重要意义•患者免疫力低下或长期使用免疫抑制剂可出现假阴性•一次检测不能区分急性和既往结核感染四、免疫学检测2结核菌素试验•是结核病初筛的主要方法之一•常用的是芒图（Mantoux）氏法，即将OT或PPD(纯蛋白衍生物purifiedproteinderivative，PPD）用无菌生理盐水稀释成不同浓度，取0.1毫升注射于左前臂掌侧前1/3中央皮内（注意：左手），72（48h～96h）小时检查反应情况，应注意局部有无硬节，不可单独以红晕为标准。•阴性反应:注射部位有针眼大的红点或稍有红肿，硬节直径小于0.5厘米•阳性反应:注射部位硬节直径在0.5-1.5厘米。•强阳性反应：注射部位反应较强烈或硬节直径超过1.5厘米以上。我国从人型结核菌制成PPD（PPD-C），又从卡介苗制成BCG-PPD，0.1ml为5IU，用于临床诊断BCG最早由法国科学家卡尔梅特(Calmette)和介朗(Guérin)研制成功的疫苗，即将有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油胆汁马铃薯培养基上长期培养传代，得到减毒菌株•阴性：无硬结或硬结平均直径5mm者•阳性：硬结平均直径在5-9mm•强阳性：硬结平均直径在20mm以上，局部有水泡，出血、坏死及淋巴管炎者•阴性反应：无结核菌感染，但应考虑以下情况：（1）如受试者处于原发感染早期，尚未产生变态反应（2）正患严重结核病，机体已丧失反应能力（3）受试者正患其他传染病，在此类情况下，均可暂时出现阴性反应•阳性反应：机体对结核杆菌有变态反应，过去曾感染过结核，但不表示有病•强阳性反应：可能有活动性感染，应进一步检查是否有结核病3酶联免疫斑点技术•以Mtb早期分泌ESAT-6和CFP-10作为特异性抗原，通过探测结核患者的特异性T细胞来诊断结核病•操作简便，耗时少，对肺结核敏感度较高•由于血脑屏障及广泛的结核潜伏感染等因素，不能作为TBM诊断的有效手段•只有儿童（小于10岁）酶联免疫斑点阳性时才予以考虑