结核病实验室质量保证及快速诊断进展-Bacteria

结核病实验室质量保证及快速诊断进展国家结核病参比实验室赵雁林[e-mail]内容1.结核病实验室工作在结核病控制中的作用2.为什么要进行EQA3.EQA培训的重要意义4.结核病实验室相关的流行病学理论5.痰涂片镜检的操作原理6.全球结核病快速诊断进展结核病实验室工作在结核病控制中的作用•诊断（发现传染源）•治疗（确定治疗方案）•疗效评价•结核病控制策略和措施的评估DiagnosisofPulmonaryTBRelatedtoNumbersofTubercleBacilliCasefrequency10102103104105106Poormicroscopy(25%)Goodmicroscopy(55%)Culture/PCR(25%)X-ray/clinicalonly(20%)←AFBpermlofsputumSlideCourtesy:VanDeunA,Nov2003细菌–让人们联想到什么?•疾病•传染性•流行性•食物腐败•在目前已知的细菌中有1%的细菌可以导致人患病•在目前已知的细菌中有4%的细菌可以导致植物得病95%已知细菌不具有致病性为什么要进行EQA•增加人员的责任心•推行标准化、规范化操作•确保实验室服务质量的提高•生物安全的需要•加强实验室网络、采集信息痰涂片镜检EQA培训的意义•强化EQA的理解，有利于积极推广•提高实验室服务质量•提高对结核病实验室工作的重视•逐步提高结核病防治人员特别是结核病实验室工作人员的地位结核病实验室相关的流行病学理论•结核病的发病学和流行•冰山理论•水库理论•病因分析和疗效评价•1.细胞•2.通过从环境中摄取化合物和能量维持其结构•3.对外部刺激的反应性•4.复制、繁衍并传递给其子代遗传信息•5.进化适应环境生命的5个基本特征结核分枝杆菌在人体中的生活周期感染感染–95%后期表现-5%病变早期进展-5%例如：HIV,婴幼儿例如：移民结核分枝杆菌的生活周期感染人体内生存由肺中排入空气中进入细胞内侵犯人体免疫防御系统免疫激活和营养限制免疫病理释放调控因子,例如sigmafactors释放抗原性蛋白改变营养需要改变细胞壁微生物和人类VeryfewmicrobesarealwayspathogenicManymicrobesarepotentiallypathogenicMostmicrobesareneverpathogenicpotentialpathogenisolatedfromordetectedinclinicalsamplesRecognisedsyndromespatient'sclinicalconditione.g.septicaemia,endocarditis,osteomyelitismeningitis,UTI,pneumoniapharyngitis我们如何知道特定的病原微生物致病?诊断和有效的治疗不仅依靠分离病原微生物，而且在于建立实验室和病人临床症状的联系如何推测特定病原体可以致病?•Koch‘s推测–病原体必须在每一例病例中都出现–病原体可以从宿主中分离并且可以在纯培养基中生长–当特定的病原体接种到健康机体时特定的疾病会发生–病原微生物可以在实验动物中恢复Spectrumofvirulencepoliomyelitisinachild0.1-1%ofinfectionsareclinicallyapparentrubella50%ofinfectionsareclinicallyapparentrabies100%ofinfectionsareclinicallyapparent传染性疾病的冰山理论asymptomaticinfectionclassicalclinicaldiseaselessseveredisease水库理论发病人数死亡人数治愈人数现有病人数痰涂片镜检的操作原理分枝杆菌的发现历史•1590年荷兰杨森父子发明了显微镜•19世纪末,显微镜技术、染色技术已应用于微生物检测,分枝杆菌的发现条件已成熟•在发现结核菌前,科霍已是一位在微生物学方面取得丰硕成果的学者.RobertKoch–第一个证明细菌可以致病•1876•传染病的微生物病因学–病因学-疾病的病因•建立“科学规则”来确定微生物和疾病的病因和效应关系•Koch’s原理Koch确定了3个重要疾病的病因•1.霍乱(fecal-oraldisease)–Vibriocholerae•2.结核病(pulmonaryinfection)–Mycobacteriumtuberculosis•3.炭疽(sheepandcattle)–Bacillusanthracis结核病Figure24.9•结核分枝杆菌：棒状抗酸菌.可以在人与人之间传播•牛型结核杆菌:美国的病例数〈１％,不在人与人之间传播•鸟胞内分枝杆菌，可以感染AIDS晚期患者分辨率和对比度•人的肉眼不能看清小于0.1毫米的物体•普通光学显微镜不能区别小于0.2微米的物体•电子显微镜不能看清小于0.1纳米的物体光学显微镜的基本原理•为区分物体不同的两点,这两点的光学成像必须落在视网膜上不同的感光细胞上;•显微镜下,光线经过显微镜物镜折射成倒立放大的实像,然后经目镜折射成正立放大的虚像;•经显微镜放大后,人眼就可以区分物体不同的两点,以达到观察微小物体的目的;•由于光线衍射的原因,普通光学显微镜不能区别小于0.2微米的物体；电子显微镜下的结核分枝杆菌Gram-positiveS.aureusGram-negativeE.coliAcidfastM.tuberculosis生理条件下细菌的表面往往带有大量负电荷•原因：细菌表面带有正负电荷的基团，等电点多在PH７以下，因此在中性或碱性条件下细菌的表面往往带有大量负电荷染色反应•Stains-saltscomposedofapositiveandnegativeion,oneofwhichiscolored(chromophore)•碱性染料–着色基团带正电荷–dye+Cl-•酸性染料–着色基团带正电荷–Na+dye-分枝杆菌涂片镜检基本原理１、待检标本中存在分枝杆菌，即受检者排菌２、分枝杆菌的特殊结构决定了染色方法：染色剂细菌表面带负电荷,与碱性复红易于结合,加热加深分枝杆菌着色程度脱色为了易于镜检，应该使抗酸菌以外的所有物质近乎完全脱色复染提供一个良好的对比，隐去背景中残留的红色，但不掩盖抗酸菌。而且，复染既要使涂片的背景易于镜检时调焦，同时又不能太深以至分散太多注意力结核菌感染及排出示意图结核病结核病细胞壁革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌分枝杆菌脂质双分子肽聚糖MYCOLATElipid+LPSporinsacyllipidsarabinogalactaLAM细胞膜•两种主要结构成分–双层磷脂doublelayerofphospholipids–蛋白质proteinsCellMembrane1.痰涂片操作程序原理2.二甲苯问题假阴性假阳性技术错误涂片:太薄/太厚、暴露在紫外线下标本中的混杂物质/加热时间过长/使用污染的木签染色:染色质量不佳、未热染、染色时结晶/环境抗酸菌、间太短、脱落、涂片未固定交叉污染脱色:脱色不佳脱色不佳复染:过染染色不佳镜检员视力缺陷、仅观察少数视野、经镜油交叉污染读片错误：未经培训未经培训记录/报告：记录错误记录错误产生错误结果的常见原因细菌感染的诊断病人临床诊断血液生化Non-microbiologicalinvestigations影像学标本分泌物标本实验室检查是临床诊断的必要环节GarbageinGarbageoutLaboratoryOUTLINE•细菌学诊断显微镜检查术培养•免疫学诊断•分子生物学诊断GenProbe噬菌体检测方法HPLC其他结核分枝杆菌的细菌学诊断培养onplatesorinbrothidentificationbybiochemicalorserologicaltestsonpuregrowthfromsinglecolony显微镜检查脱色复染染色unstainedorstainedwithe.g.Gramstain药敏血清学DNA方法bydiscdiffusionmethods,breakpointsorMICs显微镜检查•Gram-染色•抗酸染色–Ziehl-Neelsen•荧光染色–Direct,e.g.auramine–Immunofluorescence培养•Solidmedia–Agarplates•ForIdentification•ForEnumeration–Slopes–Forsafelong-termculture,e.g.Lowenstein-JensenmediaforTB•Liquidmedia(broth)–Forenrichmentormaximumsensitivity菌种鉴定•形态学•生长条件•生化反应•酶•抗原•分子生物学方法非培养的诊断方法•血清学检测•分子生物学方法•其他（HPLC）•什么是分子生物学诊断方法?•为什么用分子生物学诊断方法?•可得的分子生物学方法?45讨论的议题分子生物学方法是传统方法的必要补充•显微镜检查有假阳性-T.vaginalis,N.gonorrhoeae•胞内致病菌–viruses,M.genitalium•低敏感性–Chlamydiasp.,Neisseriasp.•慢速生长–M.tuberculosis分子生物学方法–如何发挥作用?•每个微生物拥有一些种属特异的DNA序列•分子生物学方法使得种属特异性DNA可以衡量法医鉴定分子生物学方法是一系列DNA初级结构的方法•杂交的互补序列方法•扩增合成种属特异的DNA序列-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--T-T-A-A-G-C-G-C-T-A-C--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-PCR实验室标本处理DNA准备洁净屋储存溶液混合点热循环和扩增检测QC&QA质量控制和质量保证R&DAlternatives:-commercialkits-robots+kitsNoalternative①Bactec放射呼吸测定以含有放射标记的软脂酸为底物的液体培养基，自动测量分枝杆菌代谢14C软脂酸脱致过程中释放的14CO2的量。该法药敏报告可缩短为4一12天。②分枝杆菌生长指示管法Bactec放射呼吸测定法的替代方法。以培养基中加入荧光钌复合物代替放射性标记，其荧光衰减与细菌代谢过程中O2的消耗量有关。荧光衰减可通过一系列不同的紫外透照管检测。Bactec呼吸测定流式细胞仪测定法原理:分枝杆菌细胞内的非特异性脂酶能水解培养基中加入的荧光素复合物(FDA)为游离的荧光素，因而分枝杆菌在生长过程中可造成荧光素的堆积，经FCM即可检测到。比色法①MTT法MTT法为线粒体琥珀酸脱氢酶的作用底物，可被活细胞还原形成不溶性的Formazan产物,其生成量与活细胞数量成正相关。Formazan经溶解后，可在酶标仪上测定其光吸收值。②微孔板美兰比色法美兰为耗氧指示剂，有氧时为蓝色，无氧时为粉红色。Franzblau等以美兰为指示剂在96孔微量板中培养细菌，培养基中加入抗结核药物，微量板用Parafilm封口膜封闭。若细菌为药物敏感株，可被加入的抗结核药物抑制或杀死，首先表现为氧消耗停止。而耗氧指示剂在各独立微小隔氧环境中的颇色变化可客观反映氧被消耗的程度，从而反映细菌的生长状态。•噬菌体生物扩增法将分枝杆菌噬菌体感染结核分枝杆菌，未进入菌体内的噬菌体用特异的杭噬菌体物质灭活，进入菌体内的噬菌体得到保护而复制增殖，溶菌后释放子代噬菌体，将此噬菌体与快速生长的耻垢分枝杆菌混合，接种在固体培养基上培养，观察蚀斑的产生。蚀斑的数量与噬菌体数量有关，也与在含抗结核药物培养基上存活的结核分枝杆菌数有关。噬菌体法（Fastfla