肿瘤的基因诊断

肿瘤的基因诊断温州医学院检验医学院温州医学院附一医检验科陶志华肿瘤是细胞的异常增生有结构、功能和代谢的异常具有超过正常细胞增生能力肿瘤概念在细胞内核酸代谢的异常:肿瘤细胞和正常细胞的核酸代谢有显著的不同；不同类型肿瘤细胞的核酸代谢也有较大的差异；相同恶性程度肿瘤细胞的核酸代谢也有所不同。肿瘤是一种分子病癌基因的激活抑癌基因的失活（或缺失）肿瘤发生机理原癌基因癌基因病毒癌基因肿瘤抑制基因肿瘤转移相关基因肿瘤耐药基因等肿瘤相关基因细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的基因癌基因在正常细胞的基因组中存在不表达状态表达水平不足以引起细胞的恶性转化癌基因：定位功能癌基因，产物分泌蛋白生长因子sisPDGFβ链跨膜蛋白受体型酪氨酸激酶erbB,EGF受体erbB2,EGF样受体(neu)fms,CSF-1受体膜结合蛋白G-蛋白非受体型酪氨酸激酶rasp21rassrcpp60src胞浆可溶性蛋白非受体型酪氨酸激酶丝氨酸/苏氨酸激酶信号转导连接蛋白ab1rafcrk,SH2/SH3调节蛋白vav,SH2调节蛋白胞核蛋白转录因子mycmybfosjunerbA,T3受体表1细胞癌基因按其产物定位和功能分类能够抑制细胞恶性转化或抑制细胞异常增殖的基因目前研究较多的有p53基因、pRB基因、p16蛋白、p15蛋白、p21等。抑癌基因基因染色体定位相关肿瘤基因产物及功能RB13q14RB、成骨肉瘤、胃癌、SCLC、乳癌、结肠癌p105，控制生长WT11p13WT、横纹肌肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝母细胞瘤WT-ZFP，负调控转录因子NF-117p12神经纤维瘤、嗜铬细胞瘤、雪旺氏细胞瘤、神经纤维肉瘤GAP，拮抗p21rasBDCC18q21.3结肠瘤P192,细胞粘附分子p5317p13星状细胞瘤、胶质母细胞瘤、结肠癌、乳癌、成骨肉瘤、SCLC、胃癌、磷状细胞肺癌P53控制肿瘤生长erbA17q21ANLLT3受体，含锌指结构的转录因子表2已确定的几种抑癌基因野生型P53生物学活性当DNA损伤的时候,P53基因就明显表达使细胞在G1期生长阻滞，促使细胞凋亡。抑制肿瘤细胞生长保持DNA完整性包括肿瘤转移促进基因或肿瘤转移抑制基因。肿瘤转移相关基因其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的基因。肿瘤耐药基因血小板衍生生长因子（PDGF）表皮生长因子（EGF）VGF基因等肿瘤生长因子肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断目前主要集中在以下几个方面：肿瘤转移标志物肿瘤抗药基因突变的癌基因肿瘤相关的病毒基因标志分类机制分子标志应用于癌症诊断分子遗传性染色体易位t(9；22)，t（14；18），t(11；12)等白血病、淋巴瘤等点突变p53,ERras等胃癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌等缺失BRCA1，BRCA2，DCC等乳腺癌、结肠癌改变拼接CD44，muc-1,VLA-4等结肠癌、肾癌、乳腺癌、脑瘤等扩增erb-B2,EGFR,N-myc,ras乳腺癌、脑瘤、神经母细胞瘤比例改变明胶酶A/TIMP2乳腺癌转移等病毒性病毒转化HPV,HCV,HBV，EBV宫颈癌、肝癌、鼻咽癌等组织性组织分化PSA,PSMA前列腺癌muc-18,酪氨酸酸酶，Mage-3黑素瘤AFP,白蛋白肝癌甲状腺球蛋白甲状腺癌NPGP9.5，酪氨酸羟化酶表面活性物质等神经母细胞瘤肿瘤性肿瘤细胞特征CEA肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌β-HCG黑素瘤等CK-19肺鳞癌端粒酶结肠癌、乳腺癌、头颈部癌等微卫星体等结肠癌、乳腺癌、头颈部癌等表3肿瘤基因诊断的分子标志及其应用可分为四大类I.组织特异性基因标志II.肿瘤特异性基因标志III.血管生成因子IV.其它与肿瘤转移相关的分子及基质蛋白酶及其抑制剂肿瘤转移基因标志物组织特异性基因标志物指肿瘤组织和/或起源正常组织所特有，在淋巴组织和血细胞中不存在的。如角质蛋白家族（CK）mRNA、粘蛋白基因、表皮生长因子受体（EGFR）mRNA等。.肿瘤特异性基因标志物存在于肿瘤及其起源的正常细胞中，不存在于其他细胞。如CEAmRNA、AFPmRNA、PSAmRNA等。血管生成因子如血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。肿瘤抗药基因对于肿瘤化疗效果及预后进行推测；还可以将肿瘤抗药基因导人骨髓细胞，特别是骨髓干细胞中，提高机体对于抗肿瘤化疗药物的耐受程度，如此可以加大抗肿瘤化疗药物的使用剂量，提高抗肿瘤化疗的治疗效果。肿瘤抗药基因多药抗性基因一l（MDR1），其编码的蛋白如P-糖蛋白起排流泵作用。.其它一些与细胞内药物代谢有关的基因也可以看作是肿瘤抗药基因，如谷胱苷肽S一转移酶（GST），可使机体解毒功能增强；癌基因bcl-2的表达可抑制肿瘤化疗药物所诱导的肿瘤细胞程序化死亡等。.突变的癌基因癌基因的突变是癌基因激活的重要方式和途径。除了见到较大范围片段的缺失或插人以及染色体转位之外，大多数情况下，都是少数核苷酸或单个碱基的突变。.癌基因点突变的检测单链构象多态性（SSCP）检测技术等.肿瘤相关的病毒基因EB病毒（EBV）人乳头瘤病毒（HPV）乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染对于这些肿瘤组织细胞中相关病毒基因及其编码产物的检测，可以作为这些类型的肿瘤诊断的标志。致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们极大的关注肿瘤基因诊断的常用方法PCR、RT-PCRSouthernblot杂交技术、Northernblot杂交技术基因芯片基因测序。肿瘤基因的分子诊断意义1.肿瘤的早期诊断和筛选2.肿瘤疗效监测3.肿瘤的预后判断4.肿瘤微转移检测肿瘤基因检测在肿瘤微转移检测中应用举例前列腺癌特异性基因DD3PCA3DD3PCA3是一种非编码RNA的基因，定位于9q21～22染色体。它为前列腺癌特异性基因之一，DD3PCA3mRNA仅在前列腺癌细胞中表达，而在其它正常组织和癌组织以及细胞系中均不表达。DD3mRNA14外显子扩增结果M：50bpDNALadder；1：LNCaP阳性对照；2～3：PCa；4：PIN；5～6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。DD3mRNA13外显子扩增结果M：50bpDNALadder；1：LNCaP阳性对照；2～3：PCa；4：PIN；5～6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。DD3mRNA34外显子扩增结果M：50bpDNALadder；1：LNCaP阳性对照；2～3：PCa；4：PIN；5～6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。组别例数14外显子扩增的阳性例数13外显子扩增的阳性例数34外显子扩增的阳性例数PCa10101010BPH35000PIN21111直肠癌2000直肠癌癌旁2000结肠癌3000结肠癌癌旁3000乳腺癌4000甲状腺癌2000胃癌1000胃癌癌旁1000膀胱癌2000软组织纤维肉瘤1000转移性腺癌1000淋巴结转移性黑色素瘤1000卵巢成熟性畸胎瘤1000正常肝脏1000胆囊1000胎盘1000前列腺组织和其他肿瘤组织及癌旁组织DD3mRNA检测结果M：50bpDNA标准；1：LNCaP阳性对照；2：BPH；3：健康男性志愿者；4～10为PCa；11为试剂空白。外周血DD3mRNA的RT-PCR扩增电泳图RT-PCR检测结果44例PCa组中13例可见DD3mRNA阳性结果(其中B期、C期及D期分别有为0例、2例，11例)。30例BPH患者和18名健康男性志愿者标本中均未检出DD3mRNA。外周血DD3mRNA的巢式RT-PCR扩增电泳图M：50bpDNA分子量标准；1：LNCaP阳性对照；2：阴性对照(女性)；3：BPH患者；4：健康男性志愿者；5～8：未治疗的PCa；9：试剂空白巢式RT-PCR检测结果44例PCa组中21例可见DD3mRNA阳性结果(其中B期、C期、D期分别有1例、5例、15例)30例BPH患者和18名健康男性志愿者均未见阳性结果两种方法对PCa患者外周血DD3mRNA检出率比较RT-PCR巢式RT-PCR+-+130-823注：χ2=20.2，P0.001；Kappa＝0.629，P0.001外周血DD3mRNA巢式RT-PCR方法的灵敏度M:50bpDNA分子量标准；1～6:依次为105、104、103、102、101、1个LNCaP细胞/ml全血；7:阴性对照；8:试剂空白组别DD3mRNA检出率(%，例数)PCa（未治疗）100%（11/11）BPH0%（0/30）健康男性志愿者（对照）0%（0/18）注：经卡方检验，χ2＝59.0P0.01不同前列腺疾病患者其外周血DD3mRNA检出率比较巢式RT-PCRPCa不同临床分期未治疗组和治疗组DD3mRNA阳性率比较(%,例数)临床分期DD3mRNA未治疗组内分泌治疗组B期100.0(1/1)0.0（0/2）C期100.0(3/3)25.0（2/8）*D期100.0(7/7)34.8(8/23)**合计100.0(11/11)30.3(10/33)**注：内分泌治疗组与未治疗组比较，*P0.05，**P0.01巢式RT-PCR谢谢!