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血液的MICM综合诊断背景介绍血液病是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，以贫血、出血、发热为特征的疾病。出血性疾病贫血症白细胞疾病常见血液病造血系统恶性肿瘤白血病的诊断分型MICM•FAB形态学诊断(Morphology)•免疫学检查(Immunology)•细胞遗传学检查(Cytogenetics)•分子遗传学检查(Molecular)检测方法–病史–形态学：•结构：活检•细胞学：涂片•骨髓血凝块–免疫分型：•流式细胞或免疫组化–细胞遗传学：核型分析、FISH–分子遗传学：融合基因（RT-PCR\Q-PCR)/基因突变（测序）白血病MICM诊断程序及技术白血病诊断的任务—不仅仅是FAB分类•是不是白血病？•急性？慢性？•系来源•FAB分类•预后分层•治疗、疗效判断•MRD病史+形态形态+免疫形态+免疫+遗传+分子形态+免疫+遗传+分子为什么需要MICM综合诊断？形态或病理或加细胞化学分析受观察者个体经验及分辨力的限制，一致率仅50-70%；在此基础上增加免疫组化和/或FCM分析大大增加了分型的准确率，可达90%以上；染色体、FISH及基因分析，进一步提高分型的准确率MICM整合诊断的临床意义•全面正确诊断与分型•评估预后•确立检测MRD的标志，追踪MRD•帮助建立分层、个性化的治疗•定期追踪帮助发现抗原丢失、克隆演变或突变•帮助确定病因或发病机制MICM整合报告形态学是诊断的基础，任何淋巴造血系统增生性疾病的诊断都离不开形态学诊断。形态学诊断技术包括细胞学：外周血、骨髓涂片，淋巴组织穿刺组织学：骨髓活检、淋巴组织活检骨髓活检和骨髓/血涂片•骨髓涂片细胞细微结构清楚评估红系、粒系增生情况及幼稚细胞比例具有优势•骨髓纤维化、细胞致密可干抽•可做组织化学染色（如铁染）•对缺铁性贫血、慢性疾病引起的贫血、巨幼细胞性贫血、和急性白血病的诊断尤其有帮助。•骨髓活检显示骨髓的组织结构和各成分的分布及相互关系，对巨核细胞的评估具有优势•不存在干抽和骨髓稀释•可做免疫组织化学染色•对再生障碍性贫血、低增生性白血病、淋巴瘤、转移癌、骨髓增生性肿瘤的诊断具有重要价值•血凝块：废物利用、骨髓活检的补充•注明病史骨髓涂片看细胞、骨髓活检看结构，相互补充相互验证不能相互替代骨髓/血涂片骨髓活检1.骨髓活检+3项特染2.骨髓涂片+组织化学染色（3）3.免疫组织化学染色4-10项4.血块骨髓活检可根据个性化病理诊断需要加做免疫组织化学染色！免疫组化长度≥1.5cm达标（≥1cm尚可）长度≤1cm不达标长度≤0.5cm可能存在诊断不全面（不包括皮肤、肌肉、软骨、血块等）附2张合格的骨髓涂片（晾干后再包装）血块分开固定（收费按小标本病理收费）•注意：取材部位是否有病灶保存液使用福尔马林固定骨髓活检标本长度要求取材的限制•骨髓增生不均匀(与血象不符)•取材过少•取材表浅•组织挤压•活检增生低下,涂片增生活跃骨髓增生不均匀取材较少,表浅•活检增生活跃,涂片增生低下骨髓增生不均匀涂片稀释骨髓活检与骨髓涂片细胞增生不一致流式细胞术流式细胞免疫分型的作用•确定系来源–原理：不同系有特定的抗原表达–髓系/B系/T/NK系/组织细胞和树突状细胞•确定细胞分化阶段–不同发育阶段细胞，其抗原表达不同•预后判断–有些抗原表达和淋巴瘤/白血病预后相关•治疗方法选择-治疗靶向•疗效判断、复发监测M0CD34,CD33,CD13M1MPO,CD34,CD33,CD13,HLA-DRM2MPO,CD34,CD15,CD13,HLA-DRM3MPO,CD33,CD13、CD9(HLA-DR、CD11b常阴性)M4MPO,CD33,CD15,CD14,CD13M5CD68,CD33,CD14,CD13,HLA-DR,CD36，CD64M6CD33,CD235a,CD71M7CD33,CD41,CD42b,CD61急性髓系白血病免疫表型与FAB分型相关性形态与免疫表型的符合性不足80%，不能脱离形态学单纯依赖免疫表型进行白血病的诊断与分型。FAB基于形态，两者不符以形态为主。MRD流式细胞检测–肿瘤细胞与正常起源细胞免疫表型不同•跨系表达•抗原表达不同步•抗原表达丢失•抗原表达减弱•其它抗原表达–初始免疫分型结果、白血病相关表型特点–抗体组合越多覆盖率越高、敏感性越高–假阳性、假阴性均存在–随访、动态观察更有意义流式检测标本要求•抗凝骨髓/外周血•附2张合格的骨髓涂片（晾干再包装）•完整的病史•MRD需要初次分型资料•组套12、18、24、30、36遗传学诊断技术–细胞遗传学：•核型分析：全基因检测、覆盖面广、敏感性差•FISH：针对性强、敏感性高、周期短、覆盖率低–分子遗传学：•融合基因（RT-PCR\Q-PCR)：针对性强、敏感性高•基因突变（测序、PCR）：覆盖面较大、敏感性较低•染色体异常包括染色体的结构和数量异常根据这些特征性的异常，对恶性血液病进行诊断和分类细胞遗传学G带R带C带急性白血病染色体检测的临床意义•染色体畸变可以作为急性白血病缓解和复发重要参考，最初治疗后异常核型可以消失提示CR，之后重新出现提示白血病复发，有新的核型出现，表明有进展•可以作为标志来验证骨髓移植成功与否•最初诊断的核型是急性白血病预后最有价值指标预后等级核型类型AMLALL好t(8;21)、t(15;17)、inv(16)t(12;21)、染色体数目50条的超二倍体、dic(9;12)(p11;p12)中正常、+8、+21、+22、11q23异常、del(9q)、del(7q)正常、47-50的超二倍体、t(11;14)差-5、del(5q)、-7、3q异常、复杂异常亚二倍体、近单倍体、t(9;22)、t(4;11)、t(1;19)、t(8;14)急性白血病核型的预后分级染色体检测常见问题•标本取材量不足：检测最低白细胞数为10的6次方个细胞•培养后无分裂相或分裂相少于15个：标本白细胞量低，患者正在进行化疗•结果临床不符：分子检测阳性而染色体阴性（染色体分辨率低）•融合基因BCR/ABL(P210)-CML/ALLBCR/ABL(P230)-CMLBCR/ABL(P190)-ALLPML/RARa-M3AML/ETO-M2CBFβ/MYH11X-M4EOMLL重排-M5FLP1L1-PDGFRα-嗜酸细胞增多症•基因突变JAK-2V617F/539-543突变MPL外显子10突变分子遗传学-血液病类型确诊的分子标志融合基因筛查•适用患者本筛查项目主要用于筛查ALL、AML、CML、AMMOL、CMML、MDS等血液病病种可能出现的31种融合基因或癌基因，及其融合基因的110余种剪切变异情况。适合无法确定融合基因类别的初诊患者，便于医生对血液病患者进行分子标志物的确定，并进行后续微小残留病灶的监控。本项目建议配合染色体核型分析一起检测，以免由于染色体数目异常或携带少见融合基因而造成漏诊。苏州大学附属第一医院对于初诊ALL,AML患者都建议做此项目不同疾病筛查项目•ALL融合基因筛查（18种）•AML融合基因筛查（23种）•APL融合基因筛查继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及RARα的变异性染色体易位：分别产生PLZF-RARα，NPM-RARα，NuMA-RARα和STAT5b-RARα融合基因。临床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解。•MLL融合基因筛查艾迪康医学检验中心检验报告单白血病融合基因筛查定性检测报告单姓名：性别：年龄：标本类型：科别：临床印象：送检医院：送检医生：筛查结果：检测项目检测结果检测项目检测结果MLL/AFX-MLL/AF6-MLL/ELL-CBFB/MYH11-MLL/AF1P-MLL/AF10-MLL/AF17-dupMLL-E2A/PBX1-E2A/HLF-SIL/TAL1-TEL/AML1-AML1/ETO-AML1/MDS1-TLS/ERG-MLL/AF1Q-MLL/AF4-MLL/AF9-MLL/ENL-BCR/ABL-TEL/PDGFR-DEK/CAN-SET/CAN-PML/RARa-PLZF/RARa-NPM/ALK-NPM/MLF1-NPM/RARa-TEL/ABL-HOX11-EVI1-内参基因copies阴性对照-结果提示：未检测到常见的31种融合基因，请结合其它检测和临床综合判断。备注：本检测主要用于筛查ALL、AML、CML、AMMOL、CMML、MDS等血液病病种可能出现的31种融合基因或癌基因，但本检测的阴性结果不排除少数患者具有其它罕见的变异型融合基因的可能性，请结合形态学，细胞遗传学或FISH检查结果及临床症状综合判断。接收日期：报告日期：检验人：审核人：批准人：JAK2基因突变•已列入WHO2008MPNs的诊断标准•V617F见于90%以上的PV，约50%的ET、PMF•在PV中，少部分患者为JAK2Exon12或其它突变•建议JAK2基因突变筛查检测以下几种–V617F;K539L;N542-E543del;E543-D544delMPL基因突变检测•MPL和MPNMPN中以JAK2V617F最为常见，PV、ET、PMF中的突变频率分别为96%、55%、65%。MPL突变主要见于ET和PMF，频率分别为2-5%和5-10%。MPL可用于JAKV617F阴性的ET和PMF患者的诊断。检测目的用于JAK2V617F阴性的ET和PMF患者的诊断。临床考虑ET或PMF的患者可以组合检测融合基因BCR-ABLP210JAK2V617F基因突变MPL基因突变基因阳性率临床意义预后与其他遗传异常相关性KIT5%预后因素差t(8;21)inv(16)/t(16;16)FLT320-40%预后因素差----NPM130%（核型正常）对疾病进行临时性的定义良好（如果没有FLT3突变）M4,M5CD34-CEBPA10%对疾病进行临时性的定义良好M1，M2CD7+WHO2008新界定的突变AML预后基因突变6项•CEBPA基因TAD1区突变检测CEBPA基因TAD2区突变检测CEBPA基因bZIP区突变检测C-kit17号外显子FLT3-ITD基因突变检测NPM1基因突变检测报告时间：12个工作日价格：1800元AML预后基因突变9项CEBPA基因TAD1区突变检测CEBPA基因TAD2区突变检测CEBPA基因bZIP区突变检测C-kit（8号外显子和17号外显子）FLT3-ITD基因突变检测FLT3基因592位点突变检测FLT3基因835位点突变检测NPM1基因突变检测报告时间：12个工作日价格：2700元TCR和IgH重排项目•有5-10%的患者无法通过常规方法辨别其淋巴系统的增生是恶性增生还是反应性增生。•正常淋巴细胞在成熟过程中重排是多克隆性的，但恶性肿瘤（＞98%）表现为单克隆性Ig和/或TCR基因重排。•适用患者及适应症：疑似淋巴瘤患者的良恶性鉴别诊断。淋系白血病患者的鉴别诊断及微小残留跟踪检测。•目标科室：血液科、肿瘤科、病理科现有检测方法及相关技术•PCR结合毛细管电泳技术（Genescan）：分辨率高，不易产生假阳性或假阴性•PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳技术ABL激酶区突变•伊马替尼的长期服用导致部分患者，特别是CML急变期（AP-CML）的患者，发生伊马替尼的耐药，其耐药发生率在20-30%。耐药主要由ABL激酶区突变引起，可导致药物疗效下降或失效。•适用患者：伊马替尼，尼洛替尼及达沙替尼治疗BCR-ABL阳性CML、ALL患者，建议定期检测，尽早发现耐药。•检测范围：BCR-ABL融合基因ABL激酶区52个位点ABL激酶区突变与TKI耐药的关系SaraRedaelli,et.al,JCO,2009,VOL27(3)469-471分子检测常见问题•标本取材量不足：检测最低白细胞数为10的6次方个细胞•检测内参偏低：目前原因未知•结果临床不符：分子检测覆盖范围问题，其他情况一般假