第十一章生物技术

植物生物技术第十一章转基因植物的分子检测及安全评价•第一节转基因植物的检测•第二节转基因植物的安全性评价本章主要内容第11章转基因植物的分子检测及安全性评价本章教学目的与要求►转基因植物检测方法►人们对转基因安全性的几类问题第11章转基因植物的分子检测及安全性评价第一节、转基因植物的检测►外源基因是否进入受体植物细胞►进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上►整合到染色体上的外源基因是否表达►能否产生理想的目的表型一、外源基因整合状态检测（一）、PCR检测方法•检测报告基因或目的基因•快捷、简易、灵敏等优点►1.引物的设计与合成►2.模板DNA的制备PCR对模板DNA的质量要求不高，可以直接利用细胞裂解液，或用快速微量法（CTAB或SDS法）制备基因组DNA要有阴性对照和阳性对照83.反应体系与循环参数反应体系：DNA模板，dNTP，TaqDNA聚合酶，buffer反应程序：变性(94~95oC)复性延伸(37~55oC)(70~72oC)72oC延伸10min30-35cyclesDNA扩增100万倍转基因棉花再生植株的NPT-Ⅱ报告基因的PCR检测M：1Kb的分子量标准；P：质粒；C：非转基因对照；1-27：转化再生植株►4.扩增产物检测5.PCR检测的特点：►检测迅速►灵敏度高，可以检测到纳克级外源DNA►操作方便，对DNA质量要求不高►不足之处在于假阳性偏高、不能提供整合位点的遗传信息（二）.Southern杂交及拷贝数检测•基因的碱基序列，与含有标记的探针发生同源配对，杂交后能产生杂交印迹或杂交带的转化植株为转基因植株；未产生杂交印迹或杂交带的为非转基因植株•选择不同的内切酶和探针组合，根据杂交带的片断大小及数目，可以判断外源基因的插入位点的整合情况及插入的拷贝数1.植物总DNA提取►CTAB:十六烷基三乙基溴化铵是一种去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，在低盐溶液中，复合物在溶液中沉淀，在高盐溶液中是可溶的，再加入乙醇使核酸沉淀。►SDS法：高浓度的SDS在较高的温度下裂解细胞，高盐低温下沉淀多糖及蛋白质，然后用乙醇沉淀DNA2.DNA纯度及浓度的检测：►琼脂糖凝胶电泳0.8%植物DNA呈现分子量较大的清晰条带如果DNA条带呈弥散状，表明降解如果在小分子量区存在较亮的条带，说明含RNA如果点样孔较亮，表明样品含杂质►紫外分光光度法：OD260/OD260=1.8OD260/OD2601.8含较多RNAOD260/OD2601.8含较多的蛋白质及其它杂质3.总DNA的限制性酶切►选择合适的限制性内切酶单酶切►酶切反应体系►DNA5-15ug►体积20-90ul►检测酶切效果►琼脂糖凝胶分离4.凝胶电泳分离各酶切片段►凝胶厚度0.5cm以上►样品及上样量►含分子量质量标准DNA，阳性对照，阴性对照►低电压、长时间电泳1V/CM电泳16小时5.凝胶变性及转膜双链DNA变性成为单链，用0.5MNaOH+1.5MNaCl►硝酸纤维素膜►尼龙膜毛细管转移法电转移法真空转移法►5.预杂交及杂交预杂交：在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性位点封闭剂：变性的非特异DNA，鲑鱼精DNA高分子化合物：PVP+BSA+Ficoll400杂交膜在预杂交液中，37-42°温育3-12小时杂交：加入杂交探针，65°保温摇床过夜洗膜：2*SSC—0.1*SSC洗膜►6.杂交信号的检测同位素标记的探针通过放射性自显影检测非同位素探针采用酶反应检测转基因棉花再生植株的Southern分子杂交图灵敏度高（可检测1pg的DNA样品），特异性强（可鉴别20个碱基的同源序列）是目前坚定外源基因整合最权威的方法HR16HR18HR19HR24HR26HR30HR35HR37HR38HR39YZ1二、外源基因表达的检测►基因表达包括转录和翻译两个水平转录是指以DNA(基因)为模板合成mRNA的过程翻译是指以mRNA为模板合成蛋白质的过程►检测外源基因的表达包括特异mRNA和特异蛋白质检测特异mRNA的主要方法是Northern杂交和RT-PCR特异蛋白质表达的检测方法主要有三种►①生化反应检测法►②免疫学检测法：Western杂交►③生物学活性的检测►Northern杂交──DNA和RNA分子之间的杂交►检测目的基因是否转录出mRNA的方法（一）、Northern杂交（二）RT-PCR原理：RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA为模板进行逆转录反应（reversetranscription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。mRNAcDNAPCR产物RNA提取：逆转录体系：RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物，OligodT;特异引物)RT-PCR体系：特异性引物、cDNA模板、TaqDNA聚合酶、buffer利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录；观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。GhUBQ7GhCIPK600.10.20.30.40.50.60.70.80.9HR16-1HR16-2HR19-3HR19-10YZ1DZHR24-4HR24-5HR37RelativeExpressionWesternimmunoblotanalysisofchitinase(chi)geneexpressioninleafextractoftransgeniccottonlines.（三）、Westernblot（四）、生化反应检测法►主要通过酶反应来检测►标记基因的检测（卡那霉素抗性、除草剂抗性）►卡拉霉素抗性检测：在转基因植株的顶端刚展开的幼嫩的叶片上涂抹1%（w/v）的卡那霉素水溶液，7天后，观察叶片涂抹部位的颜色反应来判断结果（黄色为敏感、绿色为抗性）ABA，转基因植株叶片B，未转基因株对照（五）、生物鉴定法►抗性转基因时，为了测定基因是否转入或者转入的是否表达,可以给转基因植株施加生物胁迫因子,如果产生抗性,表明转基因理想效果；转Bt基因的棉花中,采用抗虫筛选能够最直观地检测到抗虫基因的表达效果BAA，未转基因株对照B，转基因植株叶片本节完一、转基因植物的类型►抗病转基因植物：抗病毒转基因烟草►抗虫转基因植物：抗虫棉►抗逆转基因植物：抗旱、抗盐碱►抗除草剂转基因植物：抗除草剂转基因玉米、大豆、棉花、油菜►改良品质转基因植物：转VtA水稻►转基因药品植物：生产霍乱疫苗的胡萝卜第二节转基因植物安全性评价转基因植物的贡献►增加农作物产量►降低生产成本►减少化学农药对环境的污染►改善农作物品质►提高经济效益抗除草剂作物转基因植物的生产（图例）抗虫棉花抗CMV病毒转基因番茄抗CMV病毒转基因甜椒转查尔酮合酶矮牵牛花二、转基因产品安全吗?!►转基因生物给人类创造了巨大的经济和社会效益的同时，也可能给人类带来极大的潜在或现实危害。►康奈尔大学斑蝶事件►加拿大“超级杂草”事件►墨西哥玉米事件（一）、食物安全1.选择标记基因可能编码出对人体有直接毒性的蛋白质；2.转基因植物可能会表达出过敏蛋白；3.转基因农作物表达出的某些蛋白质，可能会潜移默化的影响人的免疫系统，从而对人体健康造成隐性的损伤4.改变农作物品质的基因，可能会改变宿主体内的代谢途径，从而改变转基因食品的营养成分5.将动物蛋白基因转入农作物中，是否会侵犯素食者或宗教信仰者的权益？把人的某些基因转入农作物或牛、羊等家畜体内，结果在农作物或家畜的肉、耐中含有人的某些蛋白质，这样做是否违反了人类伦理道德？（二）、生物安全1、转基因作物是否会成为“超级杂草”：转基因植物可能会变成野生种类，或者它侵入新的生态区域，破坏了生态平衡后而成为杂草；抗除草剂基因等可能会通过花粉传播或近缘杂交进入到杂草或半驯化植物中，结果产生出超级杂草。2、具有抗虫功能的转基因植物，其体内产生的抗虫蛋白可能使害虫产生抗性，使害虫变得更加难以防治？现在也已发现具有抗病毒功能的转基因植物，可以使相应的病毒出现抗性。3、载体介导的外源基因可能发生横向转移，重组出新的菌株或病毒。（三）、环境安全1、改变了生物的多样性和群落结构，生态系统的稳定性可能会遭到破坏。转基因生物是自然界中不存在的“人工制造”的生物，它们所具有的强大的生存竞争将使处于脆弱平衡状态的农田生态系统等遭到破坏。2、对非目标生物的危害将直接影响到对生物多样性的保护正是由于以上种种忧虑，人们对转基因食品充满了恐惧和担心。三、转基因食品安全性管理（一）安全性评价的目的转基因食品的安全性评价是安全管理的核心和基础之一，转基因食品的安全评价目的是从技术上分析生物技术及其产品的潜在危险，对生物技术的研究、开发、商品化生产和应用的各个环节的安全性进行科学、公正的评价，以期在保障人类健康和生态环境安全的同时，也有助于促进生物技术的健康、有序和可持续发展。对转基因食品安全性评价的目的：1、提供科学决策的依据；2、保障人类健康和环境安全；3、回答公众疑问；4、促进国际贸易；5、促进生物技术的可持续发展。（二）安全性评价的原则►1、实质等同性原则►2、个案评估的原则（casebycase）►3、预先防范（precaution）的原则►4、逐步评估的原则（stepbystep）►5、风险效益平衡的原则►6、熟悉性原则（familiarity）（三）关于转基因食品安全性评价的内容1.过敏原2.毒性物质3.抗生素抗性标记基因4.营养成分和抗营养因子5.转基因作为对生态环境可能造成的影响（四）、转基因食品安全性评价应注意的问题1、在保证人类健康和生态环境的同时，促进转基因食品的发展；2、小规模试验的结果能否推广应用到大规模商业化生产，需要做具体的分析；3、转基因食品的安全性评价应进行量化考核；4、转基因食品安全性评价的方法和标准应实现国际统一化；5、全食物饲喂进行的动物试验在进行时要十分谨慎，且不能持续时间太长，以避免因营养不平衡等原因掩饰了转基因食品的安全性问题。（五）、转基因食品的管理►以美国、加拿大为代表的基因工程产品生产和出口大国为代表：针对生物技术产品，而不是生物技术本身；►以欧共体及其成员国为代表：认为基因重组技术本身具有危险性；►介于2者之间，通过政策法规等管理生物安全问题安全性认证（1）生产商应提供足够的证据来证明该转基因食品是安全无害的。（2）转基因食品在世界各国被接受的程度是一个比较重要的参考因素，通常来说，被接受的产品较为可信。品种管理品种管理是转基因食品管理的基础，如果对原料品种没有进行必要的管理，就无法确定最终产品是否含有转基因成分。强制性标注（1）转基因生物的来源；（2）过敏性；（3）论理学考虑；（4）在成分、营养价值、效果等方面不同于传统食品（六）中国基因工程产品的安全性管理◆1993年12月24日，国家科委颁布实施了《基因工程安全管理办法》◆1996年7月10日，国家农业部颁布实施了《农业生物基因工程安全管理实施办法》◆2001年6月6日，国务院颁布了《农业转基因生物安全管理条例》◆2002年4月8日，国家卫生部颁布了《转基因食品卫生管理办法》2007年，国家卫生部颁布《新资源食品管理办法》本章小结与思考题：1.转基因植株的检测方法有哪些？2.谈谈你对转基因食品安全性的看法3.人们对转基因食品安全性争论有那些方面?第11章转基因植物的分子检测及安全性评价感谢大家的积极配合与投入有你的参与生命科学更精彩！