大鼠DRG

一、摘要在获取大鼠背根神经节神经元后，全细胞膜片钳技术记录动作电位和钠电流，探讨大鼠背根神经节细胞的分离方法和细胞形态以及电生理特征。结果显示在背根神经节细胞上记录的动作电位呈正立锐角三角形，静息电位小，动作电位时程短。背根神经节神经元的钠通道最大电流密度为（-62.04±4.45）pA/pF，几乎能被河豚毒素（TTX）完全抑制。背根神经节（DorsalRootGanglion，DRG）神经元是一类具有假单极结构特征的初级感觉神经元，外周感觉信息起始于它的外周末梢并从外周向中枢传导至脊髓背角，借中枢末梢释放的神经递质作用于突触后靶细胞，对感觉信息进行初步加工，完成初级感觉信息的传递。由于DRG神经元在痛觉信息传递中起着特别重要作用，所以在DRG细胞膜上促使动作电位产生传导痛觉信息的主要离子流——电压门控性钠通道的研究正受到国内外研究者越来越多的追捧。因此，分离好的DRG神经元，认知DRG神经元的好坏状态，区分DRG神经元的电生理特性就显得尤其重要。本文首次系统介绍了DRG神经元的急性分离方法及认知活的神经元好坏形态，采用全细胞膜片钳技术记录DRG神经元离子通道电生理特征，目的是使借助DRG神经元从事膜片钳技术实验者能够正确判断和认知DRG神经元及其特征。二、材料与方法2.1实验动物与溶液试剂幻灯片62.2分离单个DRG神经元幻灯片72.3全细胞膜片钳记录幻灯片82.4动作电位和钠电流的记录过程幻灯片102.5统计学处理实验动物均选为出生后30d左右的雄性成年Wistar大鼠，体重100～150g。记录动作电位的电极外液和内液分别采用记录INa的电极外液和内液。胶原酶II、胰蛋白酶（typeIII）、胰蛋白酶抑制剂（typeII-S）、等。幻灯片5动物在麻醉断头后，钝性分离带有棘突和横突的胸腰段脊柱，置于细胞外液中，用显微外科剪和显微外科镊仔细剪除与脊柱相连神经和周围的结缔组织被膜、棘突和横突，暴露椎间脊髓，牵起脊髓露出膨大附着后根的DRG，大小约1mm，表面光滑，小心用显微外科剪剪去DRG两端的脊神经干，保留膨大部分，就是DRG体。用塑料滴管吸取DRG体，移到另一个培养皿中，尽可能地剪碎DRG体，后加入胰蛋白酶I型（0.5mg/mL），胶原蛋白酶II型（1.0mg/mL），并将培养皿置于恒温振荡水浴器（35℃，80次/min）中振荡、孵育45min，显微镜下观察出现单个DRG神经元后，加入胰蛋白酶抑制剂（1.25mg/mL）终止酶的消化作用，再将DRG神经元置入离心机离心，后静置30min，待细胞贴壁。幻灯片5保持室温22～26℃，将盛有单个DRG神经元的细胞记录槽置于倒置显微镜载物台上，观察DRG神经元的形态、大小、状态的优劣度，选取直径20~40μm、胞膜完整、胞质清晰的优质DRG细胞作为记录对象，用全细胞膜片钳记录方法对细胞进行钳制，脉冲信号由Pulse+Pulsefit软件（version8.31，德国HEKA公司）控制，经EPC-9放大器（德国HEKA公司）放大后通过Ag-AgCl电极丝和被填充记录动作电位或INa电极内液的玻璃微电极导入细胞，产生的电流信号经EPC-9放大器转换，信号为Pulse软件收集并存储于计算机的硬盘中。采用IgorPro分析软件（version3.31，美国）对实验图形进行拟合分析处理并应用到论文中。玻璃微电极是用玻璃管毛胚经微电极拉制器（Narishige公司，PP-83）二步拉制尖端为1～1.5μm而成，电极冲灌电极内液，入细胞外液后电阻为2.5～3.5MΩ。补偿液接电位，调节三维操纵器（Narishige公司，MN-3和MO-203）使电极尖端移向细胞表面，对单个DRG神经元进行封接。当封接电阻达1000MΩ以上后，补偿快电容，并施加负压吸破细胞膜，后给予慢电容和漏电容补偿，形成全细胞记录模式。幻灯片5在全细胞记录模式形成后，分别进行记录动作电位和钠电流INa过程。首先是记录动作电位的钳制方案，在电流钳制条件下，注入600pA电流钳制，持续10ms，引出动作电位，稳定5min后，再一次记录动作电位，作为最后的分析数据储存于计算机。动作电位观察指标：动作电位时程复极化50%（APD50）和复极化90%（APD90），静息电位（RP），动作电位幅度（APA）。记录INa的钳制过程采用电压钳制（voltageclamp）方案，具体要求是在细胞外液中加入CdCl2（100μmol/L）以阻断Ca2+电流，电极内液中用CsCl代替KCl以消除K+电流的干扰，钳制电位-80mV，指令电位-70~+30mV，阶跃10mV，钳制时间40ms，刺激频率0.5Hz，可以记录到一组非常明显的快速内向性电流。幻灯片5三、结果与分析3.1单个DRG神经元的形态特征鼠DRG呈圆形或椭圆形长条形，大小为1~1.5mm，颜色呈发亮的黄白色，边缘光滑，可完整地从椎间孔的附着处分离下来。高倍镜下（40×10）单个DRG神经元呈圆形或椭圆形，大小不等，小细胞直径15~35μm，中细胞直径35~45μm，大细胞直径45~65μm。状态好的DRG神经元胞膜清晰、透明、完整，折光性好，边缘清脆，有光晕，隐约可见细胞核（图1（a））。状态差的DRG神经元，胞内有颗粒，颗粒分散，没有折光性，胞膜薄，胞浆呈碎裂状，看不见细胞核3.2DRG神经元的动作电位特征在DRG细胞上记录的动作电位都是典型的，均具有从0期到4期，呈正立锐角三角形态（n=8）（图2（a）），与记录正常心室肌细胞动作电位的形态相比[5]，DRG细胞的动作电位没有心肌细胞动作电位所特有的2相平台期（图2（b））。3.3DRG神经元的钠电流特征当对DRG细胞进行INA记录时，可见内向性电流在-60MV开始激活，-30MV达到最大值，然后开始减小，最大电流密度为（-62.04±4.45）PA/PF（图3（A））。给予TTX（30ΜMOL/L）作用细胞5MIN，可见各钳制电压下的电流均显著减小，最大电流密度为（-7.32±2.23）PA/PF（与对照组相比P0.01，N=8)（图3（B）），证明本实验所记录的内向性电流为INA。在TTX作用之后，改用记录钠通道的细胞外液冲灌细胞，发现最大电流密度又恢复到接近用药前的水平，变为（-54.23±2.87）PA/PF（与对照组相比，P0.05，N=12）（图3（C）），表明TTX对DRG神经元细胞的INA的抑制作用是可逆的。四、讨论利用膜片钳技术探讨神经系统疾病发生的电生理特征及其药物作用时，作为研究对象的DRG神经元要求具有呼吸活性、细胞膜完整、平滑、清洁度好，大小适中，利于玻璃微电极对细胞进行高阻抗封接等特性。从本研究得到的经验是；1、在显微外科条件下解剖大鼠DRG，实验需要解剖显微镜，显微外科钳、镊和显微外科剪，要尽量在无菌环境下进行每一个步骤。2、在夹持DRG时，千万不要夹持DRG膨大部分，应夹持DRG两端，以免损伤DRG神经元的分离成果。由于DRG所处的节段不同，大小、形态略有差异，颈膨大和腰膨大处神经节长约1.4~1.6mm，厚约0.8mm[6]，容易辨认，如果对神经节所在节段没有特别要求，多选择此处，便于实验者掌握和控制。对急性分离单个DRG神经元，实验者应注意掌握胶原酶和胰蛋白酶的量和消化时间，一般采用双酶消化，时间为45min，但要根据具体情况而定，酶量加大时，缩短消化时间。胶原酶II型较I型活性温和，笔者主张采用胶原酶II型为佳，另外，消化过程应严格在35~37℃水浴振荡摇床中低速振荡，通上小量的100%O2，在孵育到25min后，每隔约3min吸培养液1滴到显微镜下观看是否有细胞出现，一旦出现单个DRG细胞，应立即用胰蛋白酶的抑制剂终止酶的消化，不能等到45min只有控制好各步骤的要求，分离出的单个神经元细胞才能胞膜清晰、表明光洁，胞浆完整，具有很好的折光性，才能符合接下来的膜片钳钳制要求。另外，没有特别提示要求，选择细胞大小也很关键，钳制时应选择中型细胞为佳。一个好的细胞在高阻抗封接细胞膜并打孔后，活性仍然可以保持很长时间，直到整个实验药物观察顺利完成。谢谢！