诊断酶学

第六章诊断酶学教学目标与要求掌握血清酶变化的病理生理机制，血清酶测定在临床诊断中应用。熟悉血清酶的分类，同工酶及其亚型测定的临床意义。了解其生理变异、组织分布、测定方法、标本处理等对测定结果的影响。主要内容（1）概述（酶的组成、作用机制、分类）（2）酶促反应动力学（3）血清酶（血清酶分类、变化的病理生理机制）（4）酶活性浓度测定技术（5）酶的免疫化学测定（6）同工酶及其亚型的测定（7）临床常规酶类测定第一节酶学概述一、酶的概念、结构及功能(一)基本概念1.酶、核酶（ribozyme）和脱氧核酶（deoxyribozyme）2.酶的催化特：极高的催化效率、高度的特异性、催化作用的可调节性。3.酶促反应：酶催化的反应；酶活性(activity)：酶催化反应的能力；底物(substrate，S)：酶所作用的物质；产物(product，P)：酶促反应的生成物；酶的激活剂(activator）：加速酶促反应的物质；酶的抑制剂(inhibitor）：减慢或终止酶促反应的物质（二）酶的结构及功能1．单纯酶和结合酶单纯酶：只含多肽链，是单纯蛋白质。结合酶：由酶蛋白（apoenzyme）和辅因子（cofactor）组成。两者结合后形成的复合物称为全酶（holoenzyme）。与酶蛋白结合疏松的称为辅酶（coenzyme）。与酶蛋白结合牢固的称为辅基（prostheticgroup）。2．酶的活性中心（activecenter）酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域。二、酶的命名、分类及编号临床上常用的酶EC编号习惯用名英语缩写EC编号习惯用名英语缩写1.1.1.27乳酸脱氢酶LD、LDH2.7.3.2肌酸激酶CK、CPK1.1.1.37苹果酸脱氢酶MD、MDH3.1.1.3脂肪酶LPS1.1.1.41异柠檬酸脱氢酶ICD、ICDH3.1.1.8胆碱酯酶CHE1.1.1.496-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PDH3.1.3.1碱性磷酸酶ALP、AKP1.4.1.3谷氨酸脱氢酶GLD、GLDH3.1.3.2酸性磷酸酶ACP1.4.3.4单氨氧化酶MOD3.1.3.55′-核苷酸酶5′-NT2.1.3.3鸟氨酸氨甲酰基转移酶OCT3.2.1.1α-淀粉酶AMY、AMS2.3.2.2γ-谷氨酰基转移酶γ-GT、GGT3.2.1.30β-N-乙酰（基）-2.4.1.1糖原磷酸化酶GPD氨基葡萄糖苷酶NAG2.5.1.18谷胱甘肽转移酶GST3.2.1.51α-L-岩藻糖苷酶α-FU、AFU2.6.1.1门冬氨酸氨基转移酶AST、GOT3.4.23.1亮氨酸氨基肽酶LAP2.6.1.2丙氨酸氨基转移酶ALT、GPT4.1.2.13果糖二磷酸醛缩酶ALD第二节血清酶一、血清酶的来源（一）血浆特异酶：为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入血，在一定条件下被激活，从而引起相应的生理或病理变化。出凝血有关的酶或酶原、胆碱酯酶、铜氧化酶及脂蛋白脂肪酶等。（二）非血浆特异酶：①外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的酶，包括胰淀粉酶、胰脂肪酶、前列腺酸性磷酸酶等。血液中的含量与相应分泌腺的功能及疾病有关。②细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶，随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受损，最常用于临床诊断。二、血清酶的去路(一)血清酶的半寿期(T1/2)1.定义：酶失活至原来一半时所需时间。2.半寿期代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶，在血清中持续时间长。（二）血清酶的失活和排泄1.酶的清除主要是在血管内失活或分解。2.血清酶受蛋白酶水解而产生的低分子多肽或氨基酸可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基酸后被重吸收，其中大部分氨基酸可被组织利用，不能利用的氨基酸则随尿排出体外。三、血清酶的生理变异(一)性别少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异，与血清酶的来源组织有关。（二）年龄血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到老年时可有轻度升高。年龄差异也见于同工酶。（三）进食过量饮酒可使血清GGT明显升高。（四）运动多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及骨骼肌所含的酶量有关。（五）妊娠胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升高。（六）其他一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变化及家庭因素有关。四、血清酶变化的病理机制（一）血清酶变化机制（二）血清酶变化的病理机制1.酶合成异常（1）合成减少（2）合成增多2.酶释放增加大多数血清酶增高的主要原因（1）细胞内外酶浓度差异（2）酶在细胞内定位和存在形式（3）酶蛋白分子量的大小3.酶在细胞外间隙的分布和运送细胞中的酶有三种途径进入血液。4.酶的清除异常有少部分分子量小于60000的酶可从肾小球滤过，如AMY。当肾功能减退时，血中AMY活性升高，说明酶排泄障碍而导致在血液中滞留。另外胆道梗阻时，梗阻区ALP合成加强，同时ALP排泄受阻而逆流入血，造成血液中ALP升高。第三节酶活性测定（一）米-曼公式Michaelis和Menten提出的酶作用的中间产物学说:1913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的方程式，即米-曼氏方程(Michaelis-Mentenequation)：E+SESE+Pkkk123][]max[SKmSVV(二)Km与Vmax1.Km值：等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度，即V＝½Vmax时，则Km＝[S]。Km在临床上的应用：（1）反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比；（2）用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的百分率，当底物浓度为10～20Km时，反应速度可达到最大反应速度的90﹪～95﹪；（3）根据Km值选择酶的最适底物；（4）确定工具酶用量；（5）确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依据。2.Vmax：酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一定酶量下的最大反应速率。（三）影响酶促反应的因素1.底物浓度对酶促反应的影响（1）当[S]Km时，反应速率与底物浓度[S]成正比，呈一级反应，V＝Vmax[S]/Km＝K[S]——用工具酶来测定各种代谢物浓度的方法学基础。（2）当[S]Km时，反应速率与底物浓度[S]无关，V＝Vmax＝K[E]，称为零级反应，反应速率与酶浓度[E]成正比。酶学测定时一般底物浓度可选择为Km的10～20倍。2.酶浓度当底物浓度远远大于酶浓度时，酶促反应速率与酶的浓度成正比。在病理情况下，样品酶浓度很高，此时可因底物过早而且过多地被消耗，而影响酶活性测定，故需用生理盐水或其他缓冲液进行适当的稀释。但需注意稀释对测定结果的影响。3.缓冲液的种类、离子强度和pH根据对酶活性的影响不同可将缓冲溶液分为活性、抑制、惰性三类。各种体液样品也是缓冲液，应严格掌握测定样品与底物的用量比例，样品在总体积中所占的比例应不超过10%。4.温度测定酶活性时所用温度的误差应严格控制在±0.1℃。5.激活剂与抑制剂在进行酶偶联法测定酶活性时，反应体系中还必须加入指示酶甚至辅助酶，对其浓度等条件也应考虑。同时反应时间及产物对酶促反应也有影响。三、酶活性浓度的测定（一）酶活性浓度测定方法酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度（v）达到最大速度Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度[E]之间存在线性关系。按照酶促反应时间的不同可将酶活性浓度测定方法分为两大类:定时法（fixedtimeassay）连续监测法（continuousmonitoringassay）。1.定时法（固定时间法）定时法：测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量，计算酶促反应平均速度。优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误差。2.连续监测法又称速率法或动力学法，指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。优点：无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，就能将反应物变化的多点测定结果连接成线，观察到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活性，结果准确可靠。要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自动生化分析仪都能达到这些要求。（二）酶偶联测定法1.酶偶联反应（1）最简单的模式为：Ex为待测酶，A为底物，B为中间产物。A、B二物质的变化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei（为指示酶），其底物为B，反应产物为P可直接测定。（2）如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。模式为：其中，B、C均为中间产物，Ea、Ei都为工具酶。最后一个酶称指示酶Ei，其他外加的酶都为辅助酶（Ea）。PCBAEiEaEx2．酶偶联反应原理（1）当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存在几个时期：预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期。（2）延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢且不稳定，称为延滞期。在这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。（3）设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短越好，测定时间要避开此期。酶偶联法测定ALT的吸光度变化图3．对酶偶联反应的要求（1）指示酶反应必须是一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。（2）工具酶作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。最常用的偶联指示系统有两类：一类是氧化酶系统，利用氧化酶产生过氧化氢（H2O2），再加上氧化发色剂进行比色，如常用的Trinder反应。另一类是脱氢酶系统，利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反应后，通过分光光度法或其他方法直接测定NAD(P)H的变化量。（3）酶循环法（enzymaticcyclingmethods）固相酶（immmobilizedenzymes）(三)血清酶活性浓度测定条件的选择1．方法条件的选择尽可能采用连续监测法；减少操作步骤；化学试剂须具有一定纯度，不含影响反应速度的杂质；试验用水最好是纯水或双蒸水；建议使用液体双试剂。2．测定参数的设置内容包括：方法类型、波长、样品量与试剂量、稀释水量、试剂吸光度上、下限、试剂空白速率、反应时间、孵育时间、延迟时间、监测时间、底物耗尽限额、线性范围及计算因子F值。3．标本的采集、运输与保存个别酶在低温时反而不如室温稳定如LD。4．干扰因素的控制一些副反应或旁路反应干扰。其他酶的污染。底物自行发生反应。四、酶活性浓度的单位（一）酶活性单位1．惯用单位惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于单位定义不同，参考值差别很大，难以进行比较。2．国际单位（internationalunit，IU）在特定的条件下，每分钟转化1mol底物的酶量为一个国际单位。以IU表示，1IU=1mol.min-1。3．Katal单位在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量为1kat，1kat=1mol.s-1。常用单位为katal或nkatal。。Kat与IU的换算关系为：1IU=1mol·min-1=16.67nmol·s-1=16.67nkatal（二）酶活性浓度单位