玉米淀粉双酶法制取葡萄糖

综合实验报告题目：玉米淀粉双酶法制取结晶葡萄糖的工艺研究姓名：何雄飞学号：080700104学院：生物科学与工程学院专业：生物工程指导教师：朱秋享2010年11月29日-2010年12月28日II综合实验淀粉是植物体中贮存的养分，贮存在种子和块茎中，各类植物中的淀粉含量都较高，大米中含淀粉62％～86％，麦子中含淀粉57％～75％，玉米中含淀粉65％～72％，马铃薯中则含淀粉超过90％。葡萄糖在自然界中分布极广，游离状态的葡萄糖存在于植物果实中，动物中也有存在。葡萄糖是有机体能量的主要来源，是许多糖类化合物的组成部分，是多种有机醇和抗生素的糖质原料。本实验所制结晶葡萄糖是主要以玉米淀粉乳为原料，采用双酶法降解转化为葡萄糖后，经过活性炭脱色、过滤等净化处理后，再经过蒸发浓缩、降温冷却结晶、分离、烘干等工序精制而成的一种全结晶体状态的葡萄糖，在经济上有较为诱人的应用价值。本实验在前人工作的基础上，有针对地对双酶法制取葡萄糖晶体这一工艺进行了研究，主要进行了液化条件的优化选择。一、实验原理酶液化和酶糖化工艺称为双酶法、双酶法生产葡萄糖工艺是以作用专一的酶制剂作为催化剂，反应条件温和，复合分解反应较少，因此采用双酶法生产葡萄糖，可以提高转化率及糖液浓度，改善糖液质量，是目前最为理想的制糖方法。首先对淀粉进行调浆;用纯碱调pH值至6.0左右，再加入耐高温的α-淀粉酶，搅拌均匀。将调好后的淀粉浆进行糊化，其目的是打破淀粉分子的结晶结构，初步凝聚蛋白质。待到液化均匀一致，达到合格的液化液，即合理的DE值、外观透明、无白色沉淀、粘度低、蛋白质絮凝好，液化结束。将料液用酸将pH值调至4.5，加人糖化酶。经过一定糖化周期后，料液达到预期的DE值，此时可以进行料液脱色以及离子交换的纯化处理（本次实验由于时间限制以及安排不当，故未能进行离子交换）。最后，通过阶梯式降温的方法使晶体析出。二、实验仪器1、淀粉前处理800mL烧杯一只、350mL烧杯三只、玻璃棒、500mL量筒、电子天平、药匙、胶头滴管、pH试纸2、液化温度计、水浴锅3、糖化pH试纸、水浴摇床4、净化处理布氏漏斗、纱布、滤纸、真空泵、水浴摇床、玻璃棒5、浓缩结晶水浴锅、阿贝折射仪、玻璃棒6、DE测定酸式滴定管、250mL（或200mL）三角瓶、沸石、5mL移液枪一只、1mL移液枪一致、电炉、镊子、50mL量筒、电子天平、阿贝折射仪、秒表7、酶活测定分光光度计、移液枪、试管、水浴锅、酸式滴定管、锥形瓶胶头滴管三、实验试剂III玉米淀粉、碳酸钠溶液（调pH用）、盐酸溶液（调pH用）、氯化钙溶液、α-淀粉酶、糖化酶、活性炭、3，5-二硝基水杨酸、五水硫酸铜、四水合酒石酸钾纳、氢氧化钠、无水D-葡萄糖、亚甲基蓝、柠檬酸、柠檬酸钠、浓硫酸、碘、碘化钾四、实验步骤1、淀粉前处理量取蒸馏水600mL，加入到事先称取好的200g淀粉中搅拌均匀，得到1：3淀粉浆液。平均分装到三只350mL烧杯中，用Na2CO3溶液以及HCl溶液调整pH至6.0左右，加入CaCl2溶液2mL，混匀。2、液化最优条件的正交实验按步骤1继续配制淀粉浆液6瓶。将烧杯置于75℃的水浴锅中，持续搅拌至淀粉浆液粘稠成糊状。立即加入α-淀粉酶，搅拌均匀。分别置于55℃、65℃、75℃的水浴锅中，温度恒定不同的时间，期间持续搅拌。时间到后移入100℃水浴10分钟，以充分使酶灭活。冷却后测定其DE值（本实验采取的DE测定为费林滴定参考自“GB/T22482.1-2008：淀粉水解产品还原力和葡萄糖当量测定”，这里便不再赘述），以DE落在15-20内为佳。具体的实验条件控制如下：表1：液化最优条件正交实验表列号试验号温度/℃液化时间/min酶用量/(g/50g淀粉)ABC11（55）1（20）1（0.1）212（30）2（0.15）313（40）3（0.2）42（65）125223623173（75）13832193323、糖化研究出最佳液化条件之后，在最佳液化条件重新进行液化。灭活后料液冷却，调整pH为4.5，每个烧杯加入糖化酶1.20g。搅拌混匀之后分别置于60℃、65℃、70℃的水浴摇床中，震荡反应16h,取出，测定其DE值，以DE值接近96为好。4、净化糖化液冷却后用四层纱布过滤。粗略地除去絮凝物后，加入事先干燥好的3.5g活性炭（分两次添加，第一次稍多），。置于80℃的水浴摇床中震荡20min后取出，先用四层纱布过滤，后用布氏漏斗抽滤。得到无色澄清透明糖液。5、浓缩将糖液置于间歇沸腾的水浴锅蒸发浓缩，至干物质含量达70%，取出。冷却至45℃。在45℃的水浴锅中保温12h后，降至39℃继续保温12h。再降至33℃保温12h，最后降至27℃保温12h，取出。6、结晶干燥将含晶体的溶液用布氏漏斗抽滤，得到固体。将固体置于烘箱中，得到干燥的晶体，即为葡萄糖。IV7、0.1%α-淀粉酶活力的测定配制实验试剂如下：①标准葡萄糖溶液（1mg/mL):准确称取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL；②3，5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3，5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL2mol/L的NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液浑浊可过滤后使用。③0.1mol/LpH5.6的柠檬酸钠缓冲液A液（0.1mol/L柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O29.41g,用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55mL与B液145mL混匀，即为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸钠缓冲液；④2%淀粉溶液：称取2g淀粉溶于100mL0.1mol/LpH5.6的柠檬酸钠缓冲液中；实验步骤如下：①葡萄糖标准曲线的制作取7只干净的试管，编号，按表二加入试剂，做两份平行。表2：葡萄糖标准曲线的制作摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后冷却接近室温，加蒸馏水8mL，即总体积10mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以葡萄糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。②酶活力的测定取干净的试管，编号，按表三进行操作。表3：酶活力测定取样表将各试管摇匀，显色后进行540nm比色测定光密度，记录测定结果。8、糖化酶活力的测定实验采取的方法是次碘酸钠法，即在pH4.6，温度40℃的情况下每小时催化可溶性淀粉水解生成1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。配制实验试剂如下：①2%可溶性淀粉：称取绝干可溶性淀粉2g，以少许蒸馏水调匀，倾入80mL左右的试剂管号1234567葡萄糖标准液/mL00.10.30.50.70.91.0蒸馏水/mL1.00.90.70.50.30.103，5-二硝基水杨酸/mL1.01.01.01.01.01.01.0操作项目淀粉酶活力测定1230.1%淀粉酶液/mL0.50.50.5预保温将各试管和淀粉溶液置于70℃恒温水浴中保温10min3,5-二硝基水杨酸/mL1.000添加2%淀粉溶液/mL0.50.50.5保温在70℃恒温水浴中准确保温5min3,5-二硝基水杨酸/mL01.01.0沸水浴5min定容加入8mL蒸馏水V沸水中，继续煮沸至透明状。冷却至室温后，加蒸馏水定容至100mL；②pH4.6，0.1mol/L醋酸缓冲液：用0.1mol/L的醋酸溶液与0.1mol/L的醋酸钠溶液等体积混合；③0.1mol/L碘液：称取碘化钾36g，溶于100mL蒸馏水中，加入碘12.7g，溶解后定容至1000mL；④0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4gNaOH，用水溶解后，定容至1000mL；⑤1mol/L硫酸溶液：量取56mL浓硫酸（相对密度1.84），换换倒入适量水中，定容至1000mL；⑥0.025mol/L硫代硫酸钠溶液：称取硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O)6.25g，碳酸钠0.05g，溶于1000mL煮沸后冷却的蒸馏水中，存于棕色瓶内；⑦0.5%淀粉指示剂：称取0.5g可溶性淀粉，用少许水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮至透明，冷却后定容至100mL。具体实验步骤如下：①吸取2%可溶性淀粉10mL，加入pH4.6醋酸缓冲液5mL，混匀后于40℃水浴中预热10min；②加入酶液1mL（空白实验以煮沸失活的酶液代替），于40℃水浴中反应10min。反应结束时，立即于沸水浴中加热使酶失活；③取上述反应液5mL于碘量瓶，加入0.1mol/L碘液5mL及0.1mol/L氢氧化钠5mL，摇匀，在暗处放置15min，加入2mol/L硫酸溶液2mL；④以0.5%可溶性淀粉为指示剂，用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录0.1mol/L硫代硫酸钠消耗的毫升数A以及空白滴定所消耗的硫代硫酸钠的毫升数B；⑤计算酶活力。在上述条件下每小时催化可溶性淀粉生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位，即：酶活力=（B-A)×N×90.05×16/5×60/10式中：A--加酶液组平均消耗的硫代硫酸钠溶液的量；B--空白组消耗的硫代硫酸钠溶液的量；N--硫代硫酸钠溶液的当量浓度；90.05--与1ml硫代硫酸钠标准溶液(1mol/L)相当的葡萄糖的质量(g/mol)；16--反应液的总体积（ml）；5--吸取反应液的体积（ml）；60/10--反应10min，换算成1h的酶活力系数。五、实验数据与处理1、费林混合溶液的标定费林混合溶液的标定是以0.6%的葡萄糖标准液进行的，目的是在于确定费林混合液的浓度，以计算样品的还原力。表4：费林混合溶液标定记录表123初读数/mL0.601.2321.50预加后读数/mL18.6018.2021.80最终读数/mL21.5021.9041.20滴定体积/mL20.9020.6719.70平均/mL20.42VI故而，V1=20.8mL2、最优液化条件的正交实验液化过程中，淀粉浆液从最开始的白色均匀液体在75℃水浴锅中慢慢变稠糊化，白色纯度进一步提高。加入α-淀粉酶后置于水浴锅中继续搅拌，料液逐渐变稀变黄，呈黄白色均匀液体。在100℃的水浴锅灭活，溶液再度变稠变黄，最终得到淡黄色乳状均匀胶体。在表一条件下进行实验，得到的料液分别用阿贝折射仪测量其干物质浓度、量筒与电子天平测量其密度，最后测定其费林滴定消耗体积，测得数据如下（表中滴定用样品已经过8倍稀释）：表5：最优液化条件正交实验记录表列号试验号温度/℃液化时间/min酶用量/(g/50g淀粉)料液指标滴定体积mlABCD5ml质量/g干物质含量/%1211（55）1（20）1（0.1）15.392427.7226.72212（30）2（0.15）25.3721.820.8020.65313（40）3（0.2）35.402317.2017.1042（65）1235.5423.520.6020.80522315.4722.515.1015.80623125.4123.817.3016.4073（75）1325.4725.214.8014.50832135.432319.1018.40933215.3923.512.7012.10根据标准，还原力RP=100100600.021VNV；葡萄糖当量DE=DMCRP100。式中：1V—混合费林试剂在标定时所消耗的D-葡萄糖标准溶液的体积，mL；2V—在测定时所消耗的样品液的体积，mL；N—所测定样品液的稀释倍数；—样品的密度，g/mL；DMC—样品的干物质含量，%。按以上步骤，整理数据，得到如下结果：表6：最优液化条件正交实验数据处理表列号试验号温度/℃液化时间/min酶添加量/(g/50g淀粉)DE值ABCDVII11（55）1（20）1（0.1）113.90212（30）2（0.15）220.18313（40）3（0.2）322.98842（65）12318.175223125.756231222.5773（75）13224.248321320.919332131.17K157.0756.32