遗传性疾病的分子诊断

分子诊断的临床应用上海交通大学医学院检验系樊绮诗用分子生物学技术通过检测基因而达到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物学技术发展的最初阶段就有的设想。上世纪70年代人们开始在实验室进行研究，80年代以来，基因检测在许多国家已成为常规检验项目，主要用于感染性和遗传性疾病等的诊断。1953年Watson和Crick提出脱氧核糖核酸的双螺旋结构模型。1990年人类基因组计划正式启动。2001年2月科学家宣布完成人类基因组的全部序列图。DNA重组技术(DNArecombination)转基因技术(transgenictechnique)基因组学(genomics)蛋白质组学(proteomics)基因治疗(genotherapy)生物芯片(biochip)等技术已应用到医学领域，对疾病机理的认识、疾病的诊断、预防和治疗产生了深刻的影响。分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊断，也能确定个体对疾病的易感性，判别致病基因携带者并对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断。分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组成部分，成为一门新的学科。MoleculardiagnosisMoleculardiagnostics一、基因检测在感染性疾病中的应用SARS相关冠状病毒的分子诊断2003年4月，香港研究者Peiris等报告了50例严重型急性呼吸道综合征(seriousacuterespiratorysyndrome,SARS)病人的临床表现和病毒学研究结果。一种新的冠状病毒(Coronavirus)是SARS的致病原因。(Lancet,2003,361:9365)2003年4月，德国汉堡Bernhard-Nocht热带医学研究所学者Drosten等用随机扩增技术，获得一段长度为300bp的核苷酸序列。根据这段序列，建立了检测新冠状病毒的逆转录-巢式PCR和实时定量PCR技术。（）检测标本痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液、血浆、粪便。检测方法1.逆转录-巢式PCR(Reverse-NestedPCR)2.逆转录-实时PCR(Reverse-RealtimePCR)有报道显示，在可能SARS病人中病毒的检出率为100%。在疑似SARS病人中的检出率为23%。所有健康接触者中未检测到病毒。另一项研究显示检测病毒的3种方法（血清学检测、病毒分离、PCR技术）中，PCR技术的检出率最高。讨论PCR技术在疾病的早期即可获得阳性结果(早于血清转换期）。SARS患者中的阳性率约为80%，提示(当时的)PCR方法有较高的特异性但灵敏度较差，阴性结果不能排除病毒感染。对照中的阴性率约为98%~100%。讨论痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道排放是主要传播途径。血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒复制不仅发生于呼吸道。病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA，说明粪便可能也是一种传播途径。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液，提示不适合作为标本（有可能漏检）。SARS相关冠状病毒基因检测必须注意的问题必须在规范的基因扩增实验室中进行。应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴性对照。阳性结果时必须对原始样本重复检验：或者扩增另一个基因片段或在另一个实验室对同一样本进行检测。HPV基因的检测在预防宫颈癌中的作用宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，每年约有50万左右新发病例。我国每年有新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的26%。持续的人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因素，93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到HPVDNA。高危型HPV-16和HPV-18分别占宫颈癌的50%和14%。高危型HPV的持续感染可使患宫颈癌的风险增加250倍。HPVDNA的检测方法实时定量PCR(RealtimePCR)核酸扩增技术核酸杂交捕获（HybridCaptureⅡ，HCⅡ）核酸杂交+信号放大技术HCⅡ可一次检测所有致癌的13种高危型HPV。敏感度：对CINⅡ、Ⅲ和癌的检出率为98%。阴性预期值：对高度鳞状上皮细胞病变或更高度病变的阴性预期值99.9%细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，HPV基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。细胞学检查+HPV基因的检测是宫颈癌前病变和宫颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。基因检测在监测移植物排斥中的作用关于多瘤病毒人类多瘤病毒中常见的3种病毒：BK、JC、SV40。BK病毒于1971年首次从肾脏移植受体的尿液中分离出。病毒主要在宿主的细胞核内进行复制。在美国，10岁以上的正常人群中60%～80%有BK病毒感染史。感染的病毒多潜伏于肾小管上皮细胞和尿道上皮细胞中。BK病毒的重新激活大部分是由于免疫机制缺陷或大量使用免疫抑制剂后。肾脏移植术后大量使用免疫抑制剂，使BK病毒重新激活，大量复制。BK病毒复制进一步发展，成为BK病毒感染的肾间质性肾病（BKVAN）。BKVAN患者中60%~70%会发生远期的肾脏移植失败。•BK病毒感染已经成为肾脏移植远期失败的重要原因之一。•BK病毒感染越来越受到关注。早期无临床症状，后期症状与肾移植排斥和药物毒性反应相似，易引起漏诊和误诊。BK病毒感染和移植排斥治疗原则相反：BK病毒感染需要降低免疫抑制剂量，而移植排斥则应加大用量。因此，建立有效的BK病毒检测和监测体系是十分必要的。decoy细胞BK病毒感染的肾脏小管上皮细胞脱落至尿液。形态学检测敏感性较好，但特异性差。细胞形态在尿液中很容易破坏。BK病毒感染的检测BK病毒复制的检测血、尿中BK病毒核酸定量检测尿液中decoy细胞检查尿沉渣涂片原位杂交组织病理学检查（判断肾脏间质性肾病）肾脏移植术后病人BK病毒检测的研究对象瑞金医院肾脏移植术后2个月~3年的患者95例正常人标本60例研究方法尿沉渣细胞形态学检测血、尿中BK病毒DNA的定量检测结果95例患者的尿沉渣形态学检查，35例患者的尿沉渣中出现可疑的病毒感染肾小管上皮细胞（decoy细胞）。尿液中BK病毒核酸定量检测14例尿液中检测到BKVDNA，病毒载量为4×103~2×109拷贝/ml，平均为5.6×105拷贝/ml。发生病毒尿的中位时间为移植术后14个月。3例患者在临床上出现不明原因的发热、白细胞降低、缓慢的肌酐升高等症状，有1例甚至出现了尿道阻塞。临床上认为发生BKVAN的可能性较大，给予抗病毒治疗。病例1、2治疗前：尿液和血浆病毒核酸载量在104/ml~105/ml血肌酐分别为181μmol/L和168μmol/L治疗后：血浆和尿液中BK病毒已检测不出血肌酐降为160μmol/L和129μmol/L病例3治疗前尿液中BK病毒核酸载量为2×109拷贝/ml尿沉渣细胞中见到大量decoy细胞和炎性细胞治疗后尿液中BK病毒核酸载量降至105拷贝/ml尿沉渣细胞中decoy细胞明显减少讨论文献报道BK病毒的复制感染率为5%～60%，本研究中发生BK病毒复制的占14.7%。35例患者中发现decoy细胞，仅14例被证实存在病毒核酸，提示形态学检查特异性差。肾脏移植的患者容易导致包括BK病毒在内的多种病毒感染。因此是否存在BK病毒感染，形态学仅作为筛查实验。病毒核酸定量可有效地动态观察病毒核酸的复制。BK病毒核酸定量检测用于检测BK病毒是否复制为是否需要进行病理学检查提供依据监测疾病和评价治疗效果预防间质性肾病，防止移植远期失败二、遗传性疾病的分子诊断分子诊断能够检出家系中的致病基因携带者或高危个体，能够在胎儿出生前判断其是否为患者，因此分子诊断是降低单基因遗传病发病率的根本措施。单基因遗传病是由于某一基因结构的变化或基因表达异常而导致的疾病用分子生物学技术检测致病基因的遗传缺陷是诊断这类疾病最根本的手段。遗传性疾病中常见的分子异常致病基因异常而导致所载有的遗传信息受到改变，而疾病的发生则是通过遗传物质的表达产物——蛋白质（或酶等）的表现异常所致。基因突变主要包括点突变、片段性突变和动态性突变。点突变(pointmutation)包括错义突变、无义突变、移码突变。各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变蛋白质合成量下降无蛋白质合成片段性突变(fragememtalmutation)核苷酸的丢失和增多缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失插入：外来基因片段插入某一基因序列中倍增：基因内部某一段序列发生重复基因重排：基因组中原来不在一起的基因由于某些原因组合排列在一起动态性突变(dynamicmutation)以三核苷酸为单位的重复序列在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。脆性X综合征：CGG重复少年脊髓型共济失调：GAA重复Huntington病：CAG重复……遗传性疾病基因诊断的策略（一）直接诊断策略基因诊断的直接策略是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。DMD的基因检测•Duchennemusculardystrophy(DMD)是一种高发病率、高致残、高致死的X连锁的遗传性疾病，在3500个活产男婴中即有一个患者。•DMD基因的全长为250kb，有79个外显子。•DMD的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%~70%。（二）间接诊断策略间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析，可确定被检个体来自双亲的同源染色体中的哪一条与疾病连锁（致病染色体），从而判断该个体是否带有致病基因。间接诊断不是寻找DNA的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标志的多态性估计被检者患病的可能性。间接诊断：分析DNA的遗传标志的多态性真核生物染色体DNA中存在许多不同程度的重复序列，根据DNA序列出现频率的不同而分为不同类型。单拷贝序列在基因组中仅出现一次或少数几次，大多数基因(50%-80%)在单倍体中都为单拷贝。中度重复序列重复次数为数十至数万(105)次，长度多在300-7000bp，多为不编码序列，与单拷贝基因间隔排列。如Alu家族、KpnI家族、rRNA等。高度重复序列存在于基因组的间隔区和基因的内含子等非编码区重复频率可高达106以上，不转录具高度多态性，成为有效的遗传标记志已广泛用于基因定位和基因诊断双等位基因(bi-allele）多态性：限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）第一代DNA遗传标记，所含信息量有限。检测技术：Southern印迹技术多等位基因多态性(multi-allele)小卫星序列又称串联重复可变数目（variablenumbertandemrepeats，VNTR）第二代DNA遗传标志，属高度重复序列以6~70bp为单位，以串联形式排列，构成数量可变的串联重复序列等位基因常常达10个以上，信息量比RFLP大检测技术：PCR微卫星序列(microsatellite)以2~6bp为单位(如CArepeat)，又称短串联重复序列(STR)。在基因组中分布广泛，重复次数可达几十次，具高度多态性。检测技术：PCR单核苷酸多态性(singlenucleotidepoly-morphism，SNP)第三代DNA的遗传标志，其多态性仅表现为单个核苷酸的变异。在人类基因组中的数目可达300万个，是一种信息量非常大的标记系统。检测技术：DNA芯片技术凝血因子Ⅷ(F8)基因的主要遗传缺陷主要为点突变和基因缺失缺失169种插入28种点突变347种第22号内含子倒位:40%-50%重型HA间接诊断的不确定性•遗传标志所带的信息有限•新突变•基因重组•家系成员不完整三、基因检测在多基因病中的应用多基因病