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食品中大肠菌群的检验1.食品微生物检验的意义有害微生物对人类和生产的影响：引起食品变质引起食物中毒导致人体患病1.食品微生物检验的意义是衡量食品卫生质量的重要指标,也是判定被检食品能否食用的科学依据可以判断食品加工环境及食品卫生的情况,为卫生管理工作提供科学依据可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生保证产品的质量,避免不必要的损失生产环境的检验原辅料的检验食品加工、储藏、销售储环节的检验食品的检验2.食品微生物检验的范围3.食品卫生标准中的微生物指标指示菌概念:在常规安全卫生监测中，用以指示检样卫生状况及安全性的指示性微生物类型：一般性、特定性（如粪便污染）、其他项目：菌落总数、大肠菌群、耐热大肠菌群、总大肠菌群食源性致病菌及其毒素沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、致病性大肠埃希氏菌等霉菌酵母菌及其毒素黄曲霉毒素B1、B2等其他项目抗生素残留、beta-内酰胺酶、商业无菌等商业无菌概念：罐头食品经过适度的杀菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物。这种状态叫做商业无菌。保温：低酸性罐头食品——36±℃，10天酸性罐头食品——30±1℃，10天预定输往热带地区的低酸性食品——55±1℃，5~7天每日检查是否胖听、泄露开罐留样pH测定感官检查涂片染色接种4.常用仪器设备4.0光学显微镜4.1培养箱4.2水浴箱4.常用仪器设备4.3超净工作台：侧流式、直流式和外流式4.4干燥箱4.5高压蒸汽灭菌器4.常用仪器设备4.6离心机4.7滤菌器4.8均质器（匀浆器）4.9冰箱4.常用仪器设备玻璃器材及其他试管三角烧瓶烧杯玻璃棒培养皿接种环涂布棒酒精灯移液管移液器剪刀、镊子试管架一、实验目的1.了解大肠菌群在食品检验中的意义。2.掌握检验的程序和步骤。3.通过MPN检索表的检索得出实验结果。二、基本原理大肠菌群系指一群在32～37℃下24h内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。具有广泛的卫生学意义。大肠菌群的食品卫生学意义作为粪便污染食品的指标菌，MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低作为肠道致病菌污染食品的指针，大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系要求食品中大肠菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量产气克雷白氏菌ETECEIECEHEC大肠菌群耐热大肠菌群（粪大肠菌群）大肠杆菌产气克雷白氏菌O157：H7大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染。大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。耐热大肠菌群即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。致病性大肠杆菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）等。O157:H7（EHEC)肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系GB4789.3-2010《大肠菌群计数》第一法：大肠菌群MPN计数法第二法：大肠菌群平板计数法三、检测方法第一法：大肠菌群MPN计数法大肠菌群计数检验流程0将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤LST不产气（-）小导管里无气泡LST产气（+）需要用到的培养基（1）LST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL5.0g，乳糖5.0g，K2HPO42.75g，KH2PO42.75g，月桂基硫酸钠0.1g，蒸馏水1000mL。制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。（2）BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛胆粉溶液200mL，0.1%煌绿水溶液13.3mL，蒸馏水800mL，pH7.2±0.1。制法：略抑菌剂的选择大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。实验步骤及操作要点：1）无菌取样并制作梯度稀释液；2）样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。3）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。4）初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。LST结果判断大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。5）复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6）大肠菌群最可能数（MPN）的报告按5）确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。表B.1大肠菌群最可能数（MPN）检索表第二法：大肠菌群平板计数法需要用到的培养基（1）VRBA：结晶紫中性红胆盐琼脂成分：蛋白胨7.0g，酵母膏3.0g，乳糖10.0g，氯化钠5.0g，胆盐或3号胆盐1.5g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g～18g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.11）样品的稀释：如第一法2）平板计数选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。3）及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。实验步骤及操作要点：4）平板菌落数的选择选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。5）证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。6）大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。三大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法四、美国FDA标准方法——行业标准采用两步法：用于对出口食品中大肠菌群进行检验推测试验证实试验样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。将产气发酵管培养物转种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性，查MPN表，报告每ml（g）样品中大肠菌群的MPN值。思考题1．大肠菌群的检验分哪几个步骤？各有何作用？2．在糖发酵试验中，若发现发酵倒管内存在极微小的气泡，这种情况可否算作产气阳性？3．造成本实验误差的主要原因有哪些？•1、不是井里没有水，而是你挖的不够深。不是成功来得慢，而是你努力的不够多。•2、孤单一人的时间使自己变得优秀，给来的人一个惊喜，也给自己一个好的交代。•3、命运给你一个比别人低的起点是想告诉你，让你用你的一生去奋斗出一个绝地反击的故事，所以有什么理由不努力!•4、心中没有过分的贪求，自然苦就少。口里不说多余的话，自然祸就少。腹内的食物能减少，自然病就少。思绪中没有过分欲，自然忧就少。大悲是无泪的，同样大悟无言。缘来尽量要惜，缘尽就放。人生本来就空，对人家笑笑，对自己笑笑，笑着看天下，看日出日落，花谢花开，岂不自在，哪里来的尘埃!•25、你不能拼爹的时候，你就只能去拼命！•26、如果人生的旅程上没有障碍，人还有什么可做的呢。•27、我们无法选择自己的出身，可是我们的未来是自己去改变的。励志名言：比别人多一点执着，你就会创造奇迹•28、伟人之所以伟大，是因为他与别人共处逆境时，别人失去了信心，他却下决心实现自己的目标。•29、人生就像一道漫长的阶梯，任何人也无法逆向而行，只能在急促而繁忙的进程中，偶尔转过头来，回望自己留下的蹒跚脚印。•30、时间，带不走真正的朋友；岁月，留不住虚幻的拥有。时光转换，体会到缘分善变；平淡无语，感受了人情冷暖。有心的人，不管你在与不在，都会惦念；无心的情，无论你好与不好，只是漠然。走过一段路，总能有一次领悟；经历一些事，才能看清一些人。•31、我们无法选择自己的出身，可是我们的未来是自己去改变的。•32、命好不如习惯好。养成好习惯，一辈子受用不尽。•33、比别人多一点执着，你就会创造奇迹。•50、想像力比知识更重要。不是无知，而是对无知的无知，才是知的死亡。•51、对于最有能力的领航人风浪总是格外的汹涌。•52、思想如钻子，必须集中在一点钻下去才有力量。•53、年少时，梦想在心中激扬迸进，势不可挡，只是我们还没学会去战斗。经过一番努力，我们终于学会了战斗，却已没有了拼搏的勇气。因此，我们转向自身，攻击自己，成为自己最大的敌人。•54、最伟大的思想和行动往往需要最微不足道的开始。•55、不积小流无以成江海，不积跬步无以至千里。•56、远大抱负始于高中，辉煌人生起于今日。•57、理想的路总是为有信心的人预备着。•58、抱最大的希望，为最大的努力，做最坏的打算。•59、世上除了生死，都是小事。从今天开始，每天微笑吧。•60、一勤天下无难事，一懒天下皆难事。•61、在清醒中孤独，总好过于在喧嚣人群中寂寞。•62、心里的感觉总会是这样，你越期待的会越行越远，你越在乎的对你的伤害越大。•63、彩虹风雨后，成功细节中。•64、有些事你是绕不过去的，你现在逃避，你以后就会话十倍的精力去面对。•65、只要有信心，就能在信念中行走。•66、每天告诉自己一次，我真的很不错。•67、心中有理想再累也快乐•68、发光并非太阳的专利，你也可以发光。•6