基于细胞代谢流在线检测与计算分析原理的发酵系统(刘健)

基于细胞代谢流在线检测与计算分析原理的发酵系统上海国强生化工程装备有限公司2011.11.242一、国强生化工程装备技术简介3公司背景•高科技股份公司我们的宗旨:高技术含量;可靠的产品;满意的服务;带动行业进步.我们的特色:集工艺、工程、设备以及技术培训一体化国家生化工程技术研究中心(上海)控股公司质量体系证书5国强生化的优势实验室、中试、工程系统完整设计（案例）工艺优化与放大技术支持（结合工程中心）发酵罐及其他生物反应器的制造生产过程控制系统设计和分析软件的编程（本专业的高级工艺研究专家编制）新产品新技术开发（强项和己任）全面的技术交流和培训国强公司主要领域和业绩•生物制药（传统生物制药和现代基因工程制药）•食品轻工发酵•农业生物（微生物饲料、微生物农药、微生物肥料和动物疫苗）•新兴生物能源和石化环保等行业为全面带动行业技术进步提供集工艺、工程、设备以及培训一体化的平台技术服务！二、建立高水平中试及生产发酵系统目的意义8生物过程研究新技术代谢流研究高通量菌种筛选小试(50L)中试(3m3、10m3)生产规模(160m3/300m3)微观代谢流分析跨尺度相关分析和差异分析宏观代谢流分析传感系统/数据分析系统扩展计算流体力学研究代谢谱转录谱计算、发酵罐设计验证、代谢流研究验证、代谢流研究计算、发酵罐设计常规育种基因工程改造系统生物学国内外概况•随着近代生命科学的发展，以活细胞培养为基本手段的发酵工程对生物技术产业化具有愈来愈重要的意义，它的研究技术已由常规的细胞外的发酵罐操作（温度、pH、DO、培养基调整等）为主要内容到细胞内生理特性研究相结合，把离线和实时分析相结合，特别是如何解决生理调控的局部或某一时段的特点，难以对整个发酵过程控制和优化起决定性作用。国内外有关研究单位研究在发酵过程传感器和计算机数据采集技术基础上，通过多尺度参数相关分析研究，较好的解决了上述问题。近年来，随着生物过程的系统生物学研究的深入，开展基于生物信息处理的生物过程研究，上述装置技术与原理都将发生作用。•根据以上要求，其配置的有关传感技术、计算机软硬件、发酵罐设计和附件都有特殊要求。对此国内外有关公司只能提供部分的内容，大量需要专门设计。研制目的及应达到的水平•该设备应是发酵工程研究的国际先进水平，适应以各种微生物大规模培养为目标的各种研究，其中包括批发酵过程的微生物细胞生理生化特性、发酵过程参数相关分析、生物反应器混合传递特性、发酵过程工艺研究、过程优化与放大研究等。主要技术指标、特点•具有各种微生物发酵产品从实验室到中试的逐级研究的能力。•关键设备具有十个以上发酵过程传感器或传感技术。•全参数计算机控制或数据采集系统，其中包括多级数据控制或处理软件包，具有适应多尺度参数相关分析能力，可依据细胞代谢流在线检测与计算分析原理进行数据诊断功能，可处理直接参数、间接参数和实验室手工参数等历史、现时和实施数据趋势曲线。•具有网络通信能力，为发酵过程全参数数据局域网及远程分析提供基础。发酵过程的参数分类及检测直接参数通过传感器把非电量变化直接转化为电量变化，实时地送计算机数据采集。物理参数、化学参数、生物量参数就地测量(inline)、在线测量（online）手工参数:取样后实验室手工测量参数，离线输入。间接参数:由一些直接参数计算得到的各种反映过程特性的参数。反映菌体代谢活性、反应器工程特性、反应器操作特性等。直接参数物理参数化学参数温度压力功率输入通气流量泡沫水平加料速率基质前体诱导物培养液重量培养液体积生物热培养液表观粘度积累消耗量基质酸碱消泡剂细胞量气泡含量气泡表面积表面张力pH氧化还原电位溶解氧浓度溶解CO2浓度排气O2分压排气CO2分压其他排气成分成分浓度糖氮前体诱导物产物中间代谢物金属离子脱氢酶活力各种酶活力细胞内成分蛋白质DNARNA间接参数摄氧率（OUR）二氧化碳生成率（CER）呼吸商（RQ）细胞浓度（X）细胞生长速率（Rx）比生长速率（μ）细胞得率（YX/S）糖利用率氧利用率比基质消耗率（u）前体利用率产物量（P）比生产率（υ）体积氧传递系数（KLa）功率、功率准数雷诺数细胞量生物热碳平衡能量平衡设备结构组成（本体、部件、配件、配套仪器设备等）•发酵系统：全系统具有5000L（A）-500L（A）-50L（A）完整的发酵系统（含若干辅助罐系统）。•数据分析：5000L（A）-500L（A）-50L（A）具有计算机控制或数据采集系统（软硬件）以及细胞代谢流在线检测与计算分析原理实验研究与生产用高级发酵罐配置。•尾气分析系统：可在线分析样气中O2%、CO2%变化。•配套公用系统：用房配套、动力与公用系统配套系统科学设计。•其他：环保及三废处理科学要求三、基于细胞代谢流在线检测与计算分析原理中试及大生产发酵系统装置配置特点设计原理和技术方案特别说明•1、细胞代谢流分析的重要参数：在生物发酵过程中，呼吸商RQ值非常重要。要实时的得到RQ值，就必须实时的检测到CO2和O2的百分含量。本次采用氧分析仪和二氧化碳分析系统软硬件集成的PAS7000型生物发酵尾气分析成套系统连续在线检测CO2、O2的含量，并具有高可靠性和高稳定性，为生物工程的过程优化和放大研究和生产工艺改进提供实时可靠的数据。设计原理和技术方案特别说明•2、FUS-××L（A）自动机械搅拌新概念高级发酵罐系统：本系统是基于细胞代谢分析原理而设计制造。因此，除了常规的温度、搅拌转速、消泡、pH、溶解氧浓度（DO）等测量控制以外，还配置了发酵液真实体积、高精度补料量（如基质、前体、油、酸碱物）测量与控制，高精度通气流量与罐压电信号测量与控制，并与尾气CO2和O2分析仪连接。由此可进一步精确得到发酵过程计算机参数优化与放大所必需的包括各种代谢流特征或工程特征的间接参数，如摄氧率（OUR）、二氧化碳释放率（CER）、呼吸商（RQ）、体积氧传递系数（KLa）、比生长速率（µ）等。设计原理和技术方案特别说明•3、排气氧和二氧化碳测定：检测排气中的CO2、O2浓度变化，并结合对发酵过程中的发酵液体积（重量）、空气流量、罐压等的参数检测，计算出OUR、CER、KLa、μ的变化情况，再结合其他在线和离线数据，可对发酵过程中的多尺度问题进行分析。对间接参数计算必须有高精度低漂移的气体氧和二氧化碳测定。设计原理和技术方案特别说明•4、代谢分析用专用软件包：发酵之星（Biostar）1.5最新版分析软件基于细胞代谢物流检测与控制理论以及多年来在微生物发酵过程优化与放大的多尺度问题研究的具有丰富性的生物发酵过程检测软件。基于细胞代谢流在线检测与计算分析原理重要间接参数采集与计算分析氧消耗速率OUR，mol/L•hfCCCCVFOURCOOOOC)(1outoutininertiaininin2222重要间接参数介绍二氧化碳释放速率CER，mol/（L·h）fCCCCFCERinCOoutCOoutOoutCOinC2222)(1inertiain重要间接参数介绍呼吸熵RQ：表征好气微生物生理特征的重要参数22OCOQQOURCERRQ25不同碳源完全氧化时的RQ值碳源化学简式RQ碳水化合物CnH2nOn1.00烷烃CnH2n+22n/(3n+1)甲醇CH4O0.67甘油C3H8O30.75庆大霉素发酵OUR:20~30mol/h.m3金霉素发酵OUR:30~40mol/h.m3泰洛菌素发酵OUR:40~50mol/h.m3鸟苷发酵OUR:40~50mol/h.m3青霉素(200h)OUR:50~70mol/h.m3基因工程植酸酶发酵OUR:150~200mol/h.m3基因工程毕赤酵母发酵（疟疾疫苗）OUR:200~300mol/h.m3基于细胞代谢流在线检测与计算分析原理发酵过程传感、计算机与控制技术配置要求•1、流量计和控制：大中型发酵罐采用涡街流量计，小实验发酵罐用热质量流量计。重复精度±0.2%F·S，准确度±2%F·S，响应时间1~4S。基于细胞代谢流在线检测与计算分析原理发酵过程传感、计算机与控制技术配置要求•2、罐压测量：常规发酵罐保持一定的正压力主要是为了防止外界杂菌污染，因此对发酵罐压测量精度要求不高，只须就地压力表指示就可以了。但是如界测量发酵罐DO值，并进而推算装置的氧传递能力和细胞代谢流有关情况时，由于发酵罐压的波动将引起DO测量值的波动，如果本装置无罐压测量系统，将会造成对DO波动变化原因的误判断，还会造成严重的工艺分析错误和操作后果。•建议采用毛细管硅油隔离压力变送器或采用带压力变送器的隔膜式压力表。基于细胞代谢流在线检测与计算分析原理发酵过程传感、计算机与控制技术配置要求3、补料测量与控制系统：•控制系统：实验室规模小发酵罐大多采用蠕动泵+称重补料传感器大罐系统采用占空比控制可调的隔膜阀、智能称量补料装置•补料测量系统：以物料平衡计算为依据的发酵罐操作对补料精度有很高要求，由于蠕动泵的不同硅胶管径及弹性，空转或倒罐和蠕动泵进出口压差不同以及电机启动的静摩擦力等，依据转速或开通时间进行补料测量会带来很大误差。用隔膜阀进行补料也无法精确测量补料量。本装置采用电子秤称量技术进行精确的补料计量。电子秤的基本要求：–千分之一以上精度和稳定性；–由于不同补料基质的最大量不同，因此最小敏感量也不同，对同样操作环境下的信噪比将有很大区别，必需采用有效的辩识措施。–使用环境的防震与防潮措施。–与计算机控制系统的信号联接方式（4-20mA电流信号输出），提高信噪比及便于人机界面的计算机软件编制。称重补料传感器智能化称重补料系统智能化称重补料系统工作原理示意•称量传感器•耐消毒软管•耐消毒软管•进料气动隔膜阀•出料气动隔膜阀•计量罐•固定•计算机软件•计算•出料•进料基于细胞代谢流在线检测与计算分析原理发酵过程传感、计算机与控制技术配置要求4、发酵液全罐称量技术研究及选型：培养液的体积称重测量是计算OUR、CER等间接参数的基本直接参数，此外，称重测量技术对培养基的配制、灭菌时的冷凝水控制及其各种特殊或意外事故报警处理等都具有重要意义。用于小罐培养液全罐秤重的电子秤必需具备以下基本条件：•从使用要求角度，必须具备千分之一精度。•必须克服连接管道的绕性干扰和电机转动时及不同转速的转矩干扰。•克服反应罐整机摇摆所造成的局部应力集中及秤重器调零复位的支架设计。•二次仪表的设计,应具备自动标定、去皮、累计、速率等称重操作，克服震动等数据平滑，并能实现与上位计算机联机的信号输出等。•与整机计算机控制系统的信号联接方式，以及克服人工罐上操作时的瞬时接触干扰和人机界面等的计算机软件设计编制。•大罐采用差压变送器原理测定。基于细胞代谢流在线检测与计算分析原理发酵过程传感、计算机与控制技术配置要求5、搅拌电机选型和转速测量控制系统设计采用变频电机与调速系统。小罐采用稀土直流电机调速控制。基于细胞代谢流在线检测与计算分析原理发酵过程传感、计算机与控制技术配置要求6、排气氧和二氧化碳测定：检测排气中的CO2、O2浓度变化，并结合对发酵过程中的发酵液体积（重量）、空气流量、罐压等的参数检测，计算出OUR、CER、KLa、μ的变化情况，再结合其他在线和离线数据，可对发酵过程中的多尺度问题进行分析。对间接参数计算必须有高精度低漂移的气体氧和二氧化碳测定，且符合下列要求：•气体成分最低含量灵敏度应在0.01%(V/V),量程和零点漂移稳定为≤±1%FS/7d。•具有不同的量程切换，氧分析仪应以空气含量为基线，例如跨度为3%，则量程为18%到21%。•标准气及线性校正功能，达到仪器斜率及线性要求，即线性误差≤±1%FS。•发酵液尾气的预处理，克服逃液与不同温度的饱和水蒸汽含量对实际测量的影响。•发酵罐用量少的试验室，建议采用热磁氧分析仪和二氧化碳红外分析仪。对有大量试验发酵罐的中试系统，建议采用质谱仪。排气氧和二氧化碳测定本系统配置的软件主要用于对检测的CO2、O2进行分析