生物化学课件第十二章-DNA的生物合成

DNARNA蛋白质复制复制转录反转录翻译遗传信息传递的中心法则DNA的生物合成DNABiosynthesis第十二章DNA的生物合成：细胞内合成DNA的过程1、复制：以DNA作为模板指导的DNA合成，即将DNA携带的信息传至子代DNA。2、反转录：DNA合成也可以RNA为模扳指导合成作用，见于RNA病毒。3、修复合成：当各种因素引起DNA损伤时，损伤DNA可修复合成，校正错误，完成正确合成，以保持DNA结构的稳定性和遗传信息的准确性。染色体DNA的复制第一节复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA一、复制方式：半保留复制DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。•半保留复制的概念AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA•子链继承母链遗传信息的几种可能方式全保留式半保留式混合式•密度梯度实验——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。•半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。二、参与DNA复制的物质◆底物:dATP,dGTP,dCTP,dTTP◆聚合酶:依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)◆模板:解开成单链的DNA母链◆引物:提供3-OH端◆其他的酶和蛋白质因子：引物酶、单链结合蛋白、连接酶、解链酶、拓扑异构酶，等1、复制的化学反应(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi•聚合反应的特点DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3方向进行。2、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.53的聚合活性2.核酸外切酶活性5´AGCTTCAGGATA3´|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´•35外切酶活性•53外切酶活性?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。•核酸外切酶活性功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）原核生物的DNA聚合酶323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段604个氨基酸DNA聚合酶活性5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ•Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。DNA-polⅡ（120kD）•DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。•它参与DNA损伤的应急状态修复。功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA-polⅢ(250kD)原核生物的DNA聚合酶特点polⅠpolⅡpolⅢ5’端→3’端聚合酶活性（催化生成磷酸二酯键）有有有5’端→3’端外切酶活性（切除引物、突变片段）有有无3’端→5’端外切酶活性（校对）有有有功能去除引物并填补空隙、修复合成不祥链延长原核生物DNA复制中起主要作用的聚合酶是DNA聚合酶Ⅲ真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制3、解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白理顺DNA链拓扑异构酶(gyrA,B)稳定已解开的单链单链DNA结合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)运送和协同DnaBDnaC(dnaC)解开DNA双链解螺旋酶DnaB(dnaB)辨认起始点DnaA(dnaA)蛋白质（基因）通用名功能原核生物复制起始的相关蛋白质•解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链•引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶•单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整108局部解链后DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)解链过程中正超螺旋的形成•拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅱ•分类拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。•作用机制4、DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。•DNA连接酶(DNAligase)作用方式POO-O-OHO5’POO-O-O3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’•DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。•在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。•也是基因工程的重要工具酶之一。•功能基本过程：原核3个阶段（起始、延长、终止），真核4个阶段（起始、延长、终止、末端复制）三、DNA复制过程（一）复制的起始需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串联重复序列反向重复序列53531.DNA解链原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。复制中的放射自显影图象A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶SSB35352.引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol3535解链方向领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)•顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。•另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。•领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。领头链的合成随从链的合成阶段一阶段二阶段三阶段四复制过程简图•原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriterE.coli8232oriterSV40500（三）复制的终止555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶•随从链上不连续性片段的连接哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM四、真核生物DNA复制与细胞周期•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。•真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。•复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。•增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制的起始3553领头链3535亲代DNA随从链引物核小体（二）复制的延长•染色体DNA呈线状，复制在末端停止。•复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。•染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）复制的终止•端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性结构特点•由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…•端粒酶(telomerase)•端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)•端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)•端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)组成端粒酶的催化延长作用爬行模型DNA聚合酶复制子链进一步加工1、螺旋松弛与解链：拓扑异构酶（TopoⅠ、Ⅱ）、解链酶（解螺旋酶）、单链结合蛋白（SSB）2种起始方式：复制叉式复制与滚环式复制；多数为定点双向（双叉）复制原核生物一般只有1个复制原点（起始点origin，ori），属于单复制子复制；真核生物具有多个复制原点，属于多复制子复制复制时DNA双链打开，形成的“Y”字型结构称为“复制叉”小结2、引发（RNA引物合成）：引物酶（DnaG）及引发体（其它的Dna蛋白）原核生物复制时的RNA引物较长，真核生物的引物较短3、链延长（形成磷酸二酯键）：DNA聚合酶Ⅲ(原核)、DNA聚合酶α、δ（真核）半不连续复制：先导链（领头链）、随从链冈崎片段（Okazakifragment）：随从链中不连续合成的DNA片段。原核生物的冈崎片段较长，真核生物的冈崎片段较短新合成链的延长方向：5’端→3’端碱基配对：双链反平行，AT,GC配对原核生物的链延长速度大于真核生物4、终止（水解引物、填补空缺、连接DNA片段）：DNA聚合酶Ⅰ（原核）、连接酶原核生物真核生物起始点1个多个引物长短冈崎片段长短链延长速度快慢末端复制少见常见DNApolⅠ、Ⅲα、δ连接酶的功能物NAD+ATP真核生物与原核生物复制的主要差别真核和原核DNA细胞复制比较DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)andRepair第二节遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNAdamage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变