骨骼肌活组织检查病理诊断技术的改进及应用

书书书!技术方法!骨骼肌活组织检查病理诊断技术的改进及应用张!燕韩志慧钟延丰!王盛兰李玲玲郑丹枫!北京大学基础医学院病理学系北京!##$#!摘!要目的!对%##例骨骼肌活组织检查!活检#标本进行组织学切片和染色总结分析技术方法的操作过程和改进重点探讨各种肌酶及非酶组织化学染色技术在神经肌肉病诊断中的应用选择和价值$方法!将标本经异戊烷&液氮速冻后进行冰冻切片应用’(及)*+*,-三色!)./#%糖原!012#%脂肪!油红3#等特殊染色肌球蛋白三磷酸腺苷酶!140酶#%还原型辅酶!四唑氮还原酶!516’&4/#等酶组织化学染色并对各种染色技术进行调整和改进$结果!标本经异戊烷&液氮速冻及恒冷切片可以有效避免产生冰晶$)./染色主要显示线粒体及肌纤维变性坏死的病变油红3染色显示肌纤维内有无脂质增多012染色主要显示糖原和糖蛋白$对于肌肉组织应用冰冻切片优于石蜡切片$516’&4/及140酶染色可以区分两型肌纤维并可观察肌纤维内部结构及线粒体酶的变化等$结论!通过骨骼肌酶与非酶组织化学染色技术可以清晰地显示出两型肌纤维的分布情况及各种特征性的病理改变几种方法可互为补充$!关键词肌骨骼&活组织检查&冷冻超薄切片术&免疫组织化学&染色与标记!中图分类号/%789!!!文献标识码1!!!文章编号7:&7:;!9##$##&#=$&#!#’#8%$7$?8-@@A87:&7:;89##$8#8#B$%&’()%)*+,*!,&&-#.,+#*/!#,0*1+#.+).2*#34)1/+2)15)-)+,-%41.-)6#&17C’15)DEA’15CF-&FG-C’35)DEA&HIAJ!K15)2FIAJ&LEAMNM-AJ&L-AJC’(5)6EA&HIAJ!6IOE,P+IAP*H0EPF*L*JQ0IR-AJSA-TI,@-PQ2UF**L*[e-mail]-UEL2U-IAUI@VI-?-AJ##$XF-AE#89:;8=;!6?).+#()’4*@G++E,-YIPFI-+O,*TI+IAP*HTE,-*G@+G@ULI@PE-A-AJPIUFA-ZGI@EAWW-@UG@@PFI-,EOOL-UEP-*A-AW-EJA*@-@*HAIG,*+G@UGLE,W-@IE@I@8@)+2!1’4F,IIFGAW,IWUE@I@*H@RILIPEL+G@&ULI[-*O@Q@E+OLI@\I,II]E+-AIW[QF-@P*OEPF*L*J-UEL+IPF*W@84FIHLE@F&H,IIY-AJPIUFA-ZGI@\I,IG@IWH*,PFIO,IOE,EP-*A*HH,*YIA@IUP-*A\F-UF\I,I@PE-AIW\-PF’()*+*,-P,-UF,*+-U!)./#JLQU*JIA!012#EAWHEPEU-W!*-L,IW3#&PFIIAYQ+IF-@P*UFI+-UEL@PE-A-AJ\-PF+Q*@-AEWIA*@-AIP,-OF*@&OFEPE@I!140E@I#EAW516’&4/84F*@I@PE-AIW+IPF*W@FEW[IIA-+O,*TIW84FI-++GA*F-@P*UFI+-&UEL@PE-A-AJ\-PFWQ@P,*OF-A&EAWP,EA@+-@@-*AILIUP,*A-U+-U,*@U*OQ\I,IG@IW8)14-+1’6IIOH,IIYI\-PFFIPI,*OIAPEAI&L-ZG-WA-P,*JIAEAWHLE@F&H,IIY-AJPIUFA-ZGI@U*GLWET*-WE,P-HEUP@*H-UIU,Q@PELTEUG*LEP-*A8)./@PE-A-AJ+E-ALQ@F*\IWPFIWIJIAI,EP-TIEAWAIU,*P-ULI@-*A@*H+-P*UF*AW,-EEAW+G@ULIH-[I,@83-L,IW3@PE-A-AJ@F*\IWPFI-AU,IE@I*HL-O-W-A+G@ULIH-[I,@8012@PE-A-AJ+E-ALQ@F*\IWJLQU*JIAEAWJLQ&U*O,*PI-A81OOL-UEP-*A*HH,*YIA@IUP-*A@-A+G@UGLE,P-@@GI\E@[IPPI,PFEAPFEP*HOE,EHH-A@IUP-*A@8516’&4/@PE-A-AJEAW140E@I@PE-A-AJU*GLWW-@P-AJG-@FPFIP\*PQOI@*H+G@ULIH-[I,@EAW@F*\PFIUFEAJI@*H-AAI,@P,GUPG,I*H+G@ULIH-[I,@EAW+-P*UF*AW,-EIAYQ+I@8=*.-41#*’4FIW-@P,-[GP-*AEAWUFE,EUPI,-@P-UOEPF*L*J-UELUFEAJI@*HPFIP\*PQOI@*H+G@ULIH-[I,@UEA[I@F*\IWULIE,LQ[QIAYQ+IEAWA*A&IAYQ+IF-@P*UFI+-UEL@PE-A-AJPIUFA-ZGI@*HPFI@RILIPEL+G@ULI84FI@I+IPF*W@UEAU*+OL-+IAP\-PFIEUF*PFI,83ALQEHPI,GAWI,@PEAW-AJPFIPIUFA-UELO,-AU-OLI@UEA\I+E@PI,EAWEOOLQPFI@I+IPF*W@8ABCDE:!.G@ULI@RILIPEL&V-*O@Q&X,Q*GLP,E+-U,*P*+Q&N++GA*F-@P*UFI+-@P,Q&2PE-A-AJEAWLE[IL-AJ基金项目#国家自然科学基金!%#7:#:$#资助2GOO*,PIW[QPFI5EP-*AEL5EPG,EL2U-IAUI@^*GAWEP-*A*HXF-AE!%#7:#:$#!X*,,I@O*AW-AJEGPF*,(@I&+E-LYF*AJQH_[?+G8IWG8UA!!肌肉活组织检查!活检#是从肌肉组织中取下小块样本进行病理学检查是神经肌肉病诊断的一种重要方法$近年来骨骼肌冰冻切片和酶组织化学染色技术的开展以及电镜检查的应用使肌肉活检在肌病的诊断过程中起着越来越重要的作用$肌肉组织的处理和染色与一般病理标本的处理相比有其特殊性$处理不好很容易产生人工伪像而影响诊断$本文重点探讨了肌肉活检的技术方法特别是各种肌酶及非酶组织化学染色技术的基本操作和方法的改进进而探讨各种肌肉染色技术在神经肌肉病诊断中的应用选择和价值$FG资料与方法F8F!取材人骨骼肌组织活检标本%##例均取自北京大学第三医院神经科患神经肌肉病的患者$依照患者)$=)北京大学学报!医学版#‘3S/51M3^0(aN5)S5Nb(/2N4D!’(1M4’2XN(5X(2#!b*L8!5*8!1GJ89##$病情不同标本分别取自三角肌%股四头肌和腓肠肌大小约#cBU+d#cU+d#cU+$采取标本时注意取肌腹部位避开曾经做过肌电图检查的肌肉$F8H!组织处理标本用吸水纸吸干水分分为%部分分别做恒冷冰冻切片%石蜡切片及电镜切片$F8H8F!恒冷冰冻切片!将适量黄漆胶用水调成糊状将组织纵行立于其上然后进行异戊烷&液氮速冻$取一小烧杯倒入异戊烷将异戊烷置于液氮内预冷至无气雾时将准备好的组织迅速浸入#e9#@后取出于f9#g内保存$切片于恒冷切片机内进行厚度:e#+切片除进行常规’(染色外还分别进行几种酶组织化学和组织化学染色$F8H8H!石蜡切片!标本以#h!体积分数#甲醛固定常规石蜡包埋切片做免疫组织化学染色!(A&T-@-*A4.两步法#$F8H8I!电镜切片!标本以9c=h!体积分数#戊二醛固定常规制作电镜切片应用‘(.##X;&#透射电镜观察$注意电镜标本应该横埋以观察纵切面$F8I!改良)*+*,-三色!)./#染色)*+*,-染液!O’值%c#的配制’丽春红9/#c7J固绿^X^#c%J磷钨酸#c7J冰醋酸J加蒸馏水##+M$先用蒸馏水溶解磷钨酸然后用此溶液分别溶解丽春红和固绿再将9份溶液混合加入冰醋酸最后用氢氧化钠调O’值至%cg冰箱内保存$丽春红染液的配制’丽春红9/c9J磷钨酸#c7J冰醋酸J加蒸馏水至##+M$染色方法’’E,,-@苏木素浸染=+-A流水冲洗=+-A丽春红染液染色#+-A)*+*,-染液浸染#e=+-A#c9h!体积分数#冰醋酸分化%#@$=h!体积分数#酒精及##h!体积分数#酒精脱水透明树脂封片$注意事项’)*+*,-染液应在冰箱内保存保存期限约为7个月保存期内使用可以保证染色鲜亮$F8J!油红3染色饱和油红3的配制’$$h!体积分数#异丙醇##+M油红3#c=J$=g加热直至溶解$粗滤纸过滤室温存放用前再次过滤$油红染液的配制’7+M饱和油红3+M蒸馏水混合%过滤!均需在密闭缸中进行#$染色方法’苏木素浸染=+-A流水冲洗=+-A7#h!体积分数#异丙醇浸过一下蒸馏水洗明胶封片$注意事项’油红3染液需新鲜配制使用密闭封缸过滤及染色避免异丙醇挥发影响染色效果$F8K!糖原!012#染色2UF-HH氏液的配制’将J碱性品红溶解于9##+M已煮沸的蒸馏水内搅拌=+-A后冷却至=#g过滤加入+*LM的盐酸9#+M冷却至室温!约9=g#加入J偏亚硫酸氢钠!或钾#$避光放置过夜$待溶液呈黄绿色时加入9J活性炭摇动混合+-A滤除活性炭溶液呈透明无色液体g冰箱保存$染色方法’h!体积分数#过碘酸#e=+-A水洗$2UF-HH液浸染9#+-A流水冲洗=+-A苏木素复染树脂封片$注意事项’过碘酸应置于冰箱内保存保质期约个月$F8L!还原型辅酶!四唑氮还原酶!516’&4/#染色516’&4/孵育液的配制’#c#=+*LM4,-@缓冲液!O’:c7#+M加入516’#c+J充分溶解后加入氯化硝基四唑氮!5V4#+J$染色方法’516’&4/孵育液%:g孵育F蒸馏水洗$7#h!体积分数#丙酮%$#h!体积分数#丙酮%7#h丙酮依次分色蒸馏水洗甘油明胶封固$注意事项’516’液孵育时间长短与组织有相当大的关系通常染色时间要大于9F镜下观察至两型纤维有明显深浅差别时终止显色$F8M!肌球蛋白三磷酸腺苷酶!140酶#染色碱性孵育液的配制’#c+*LM巴比妥钠i#cB+*LMXEXL9i蒸馏水jii%至O’#c9及O’#c$酸性孵育液的配制’#c9+*LM巴比妥醋酸盐溶液i#c+*LM’XLi蒸馏水j=i#iB至O’c9及O’c7$中性孵育液的配制’#c+*LM巴比妥钠i#cB+*LMXEXL9i蒸馏水j9ii:调至O’$c:$反应液的配制’中性孵育液9#+Mk140&5E=#+J$染色方法’分别将碱性O’染色切片置于酸性孵育液内=+-A酸性O’染色切片置于中性孵育液内=+-A再将全部切片置于中性孵育液内孵育=+-A$h!质量分数#XEXL9溶液洗#+-Ad%&置于9h!质量分数#X*XL9溶液内%+-A&#c#+*LM巴比妥钠溶液内洗B次流水洗7#@&置于h!质量分数#黄色硫化铵溶液中%#@流水洗=+-A$:#he##h!体积分数#梯度酒精脱水二甲苯透)#7)北京大学学报!医学版#‘3S/51M3^0(aN5)S5Nb(/2N4D!’(1M4’2XN(5X(2#!b*L8!5*8!1GJ89##$明两次封固$以上化学染料均购自上海化学试剂三厂及北京益利精细化学品有限公司516’&4/及140酶购自丹麦6ER*公司$F8N!其他酶组织化学染色特殊病例可以加染刚果红%磷酸酶等$HG结果H8FG’(染色可以精确辨认组织的微细变化及各种细胞形态!图#$石蜡包埋’(染色切片对于炎症细胞及间质%血管病变的辨认优于冰冻切片$H8H!)*+*,-染色肌纤维呈灰绿色肌原纤维网呈暗红色线粒体呈红色$此种方法主要显示线粒体的病变如图9细胞膜下出现大量红染的颗粒状物质为异常病变的肌纤维$H8I!油红3染色脂滴呈桔红色如图%组织标本取自一例%岁女性患者的腓肠肌肌纤维内出现大量桔红色颗粒诊断为脂质贮积症$H8J!012染色主要显示糖原和糖蛋白与肌质网均呈红紫色$对于肌肉