转基因技术

哺乳动物转基因技术TransgenesisinMammals中国农业大学动物科技学院曾申明1.Introduction⑴Definitionandapplication⑵Historyofthistechnique⑶MechanismsofexogenousDNAintegration⑷FactorsaffectingtheactivityofexogenousDNA2.ProceduresofTransgenicAnimalProduction⑴Reconstructionofexpressionvectors⑵Methodsforgenetransferorgeneknockout⑶Detectionofexogenousgeneactivity⑷Establishmentoftransgenicanimallineandbreeding3.ProblemsExistedinAnimalTransgensis4.Prospects1.Introduction⑴Definitionandapplications它是通过一定方法把人工重组的外源DNA导入受体动物的基因组中或把受体基因组中的一段DNA切除，从而使受体动物的遗传信息发生人为改变并且这种改变能遗传给后代的一门生物技术。通常把通过这种方式诱导遗传改变的动物称作转基因动物（TransgenicAnimals）。哺乳动物转基因技术自本世纪七十年代诞生以来，由于它在农业、医学和生物学中的重要应用价值，已引起世界各国的广泛关注，并取得长足进展。①在基础生物学中用于研究真核细胞的基因转录、表达和调控规律以及个体发育的分子调控规律。借助转基因动物模型可将分子、细胞、组织、器官及个体的发生、发育和衰老统一起来，从时间和空间角度综合研究基因的表达调控规律。如利用神经组织特异性或心肌组织特异性调控因子与绿色荧光蛋白（GFP）或β－半乳糖苷酶（LacZ)等标记基因构建在一起，然后生产转基因动物，通过检测组织中标记基因的表达产物可研究神经或心肌细胞的分化和发育规律。动物基因组中某一DNA片断的敲除（Knockout)或定向插入某一DNA片段（Knockin)可用于研究这一基因的表达产物，生物学功能，调控规律或其它基因的调控功能。②在医学上A.制备动物疾病模型与疾病相关的基因被克隆后,通过转基因技术制备动物疾病模型,可用来研究疾病的发生、发展规律和治疗药物的筛选,以此确定确定此疾病的最佳治疗方案。目前，在世界范围内发现人类的遗传疾病有3500多种,已建立约15种转基因疾病模型，其中包括糖尿病、高血脂症、β－地中海或镰刀型贫血症，阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sDisease),动脉粥样硬化症等常见的疾病。B.用以研究癌基因的活动规律和肿瘤的发生机理。如SV40的启动子与胰岛素或晶状体蛋白基因重组后,制备的转基因动物出现胰腺瘤或晶状体瘤,进一步研究发现SV40启动子的72个核苷酸与肿瘤的发生有密切关系,已建立乳腺癌和前列腺癌的小鼠。C.用以治疗遗传疾病随着人类基因组计划的完成和基因定点整合技术的成熟，转基因技术有可能治愈人类的遗传疾病。D.生产人的代用器官用表达病人补体调节蛋白基因或敲除细管内皮细胞表面抗原决定簇基因猪的器官可替代人的患病器官,延长病人的寿命。Thefirstanimaleverpatented.Thismouse,theso-calledoncomouse,HarwardUniversityreceivedapatentforthetransgenicanimalsin1988,hasbeengeneticallymodifiedsothatitscellsarepronetocancer.Itwasproducedbymicroinjectionc-mycandmousemammarytumorvirus.③在畜牧业中A.加快生长速度，提高饲料报酬。把生长激素(GH)或促生长因子(IGF-I,II)基因导入家畜基因组中，能加快生长速度，提高饲料报酬。如表达牛生长激素的转基因猪生长速度比对照组快10％~15%，饲料报酬能提高16％~18%，胴体中脂肪下降80%。Growth-enhancedTransgenic(900g)andcontrol(350g)Catfishatthesameageaboutoneyear.Growth-enhancedTransgenic(730g)andcontrol(15g)salmonatthesameageaboutoneyear.③在畜牧业中A.加快生长速度，提高饲料报酬。B.提高家畜对疾病的抵抗力。如把病毒衣壳蛋白基因导入动物基因组后，当这些基因表达时，机体就会产生抵抗这种病毒入侵的抗体,或把干扰素基因导入动物基因组中,当干扰素表达时动物的抗病毒性增强。③在畜牧业中A.加快生长速度，提高饲料报酬。B.提高家畜对疾病的抵抗力。C.提高家畜经济性状的生产力。如导入乳脂合成抑制酶的基因，可降低奶中的乳脂含量；把原核生物的半胱氨酸合成酶基因导入绵羊基因组中，当这一基因表达时可提高羊毛的产量。③在畜牧业中A.加快生长速度，提高饲料报酬。B.提高家畜对疾病的抵抗力。C.提高家畜经济性状的生产力。D.制备家畜生物反应器(Bioreactor)。把药用蛋白或营养蛋白基因与组织特异性表达调控元件藕联，运用家畜的造血系统、泌乳或泌尿系统生产药用或营养蛋白质，建立基因或分子牧场（GeneorMolecularFarming)，提高畜牧业经济效益。1.Introduction⑴Definitionandapplications⑵HistoryofthistechniqueA.1953年J.D.Watson&F.H.C.Crick提出DNA双螺旋结构.Watson,CrickandWilkinswereawardedtheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1.Introduction⑴Definitionandapplications⑵HistoryofthistechniqueA.B.1960~1970SWernerArber,HamiltonSmithandDanielNathans发现了DNA限制性内切酶.他们获得了1978年的诺贝尔生理学或医学奖。1.Introduction⑴Definitionandapplications⑵HistoryofthistechniqueA.B.C.1973年Boyer&Cohen进行了DNA重组实验并获得成功.1.Introduction⑴Definitionandapplications⑵HistoryofthistechniqueA.B.C.D.1974年美国科学家Jaenisch等人在把猿猴病毒40(SV40)注入小鼠囊胚腔中，得到部分体组织中含有SV40DNA的嵌合体小鼠，在1976年他们建立了世界上第一个转基因小鼠系，这些小鼠基因组中插入了莫氏白血病病毒基因。他们是运用反转录病毒与小鼠卵裂球共培养把外源DNA插入到小鼠的基因组中。E.1980年，Gordon等把SV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。F.1982年,Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照组小鼠2倍的“超级鼠”，首先证明外源基因可在受体中表达，并且表达产物具有生物活性。这一结果发表后，哺乳动物的转基因技术引起生物学界的广泛重视并得到迅速发展。转基因家兔、绵羊和猪（Hammer等，1985）、牛（Bondioli等，1988）和山羊（Ebert等，1991）等相继出世。G.转基因研究方向的变化在转基因研究初期，人们试图通过导入生长激素基因或与生长相关的基因获得“超级家畜”。但是，大多数转基因家畜在生长速度和饲料报酬得到提高的同时，却出现多种病态，如关节炎、胃溃疡和心肌炎等，导致转基因家畜寿命短，死亡率高。出现这种现象的根源是这些转基因动物长期处高生长激素状态，代谢平衡遭到破坏。解决这一问题的关键是采用准确启闭的调控元件，使生长素在家畜的生长高峰期表达，在幼年和成年期关闭，但目前的转基因技术还无法解决这一问题。因此，用转基因技术提高家畜的生产性能还需要作深入研究，近期难以在生产运用。近年来，转基因动物被用来生产非活性蛋白或用外分泌器官生产活性蛋白。1987年，Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到了绵羊的β-球蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了α-抗胰蛋白酶。后来，抗凝血因子IX（Clark等，1989）、组织纤维蛋白溶酶原激活因子（TPA）(Ebert等，1991)、蛋白质Ｃ（Velander等，1992）、凝血因子Ⅷ(Halter等，1993)，白细胞介素－2（Buhler等，1989）等相继在转基因动物的乳腺中表达。目前大约有30多种外源蛋白质基因在转基因动物腺中表达，其中α-抗胰蛋白酶最高表达量为每升绵羊乳汁中达到35克。1992年Swanson等用转基因猪生产出人的血红蛋白，尽管表达量低，无法进行规模生产，但它提出了用转基因动物生产人血红蛋白的可能性。1994年Fodor等开始探讨用转基因猪器官作为人器官移植供体的可能性，为异体器官移植提出新构想。H.转基因方法的探索反转录病毒转染→显微注射→精子载体→ES细胞转染、基因打靶→性原细胞转染→体细胞转染、打靶和细胞核移植转基因1.Schniekeetal.HumanfactorIXtransgenicsheepproducedbytransferofnucleifromtransfectedfetalfibroblasts.Science.1997,278:2130-2133.2.McCreathetal.Productionofgene-targetedsheepbynucleartransferfromculturedsomaticcells.Nature.2000,405:1004-1005.3.Keeferetal.Generationofdwarfgoat(Caprahircus)clonesfollowingnucleartransferwithtransfectedandnontransfectedfetalfibroblastsandinvitro-maturedoocytes.Biol.Reprod.2001,64:849-856.4.Laietal.Productionofa-1,3-galactosyltransferaseknockoutpigsbynucleartransfercloning.Science.2002,295:1089-1092.1.Introduction⑶MechanismofexogenousDNAintegrationA.随机整合（RandomDNAIntegration）B.同源重组（HomologeousRecombination）C.基因打靶（Genetargeting)P:阳性选择标记基因，N：阴性选择标记基因,G418r:新霉素抗性基因(neor）表达时表现对G418产生抗性，GANCr:疱疹病毒胸苷激酶（HSVtk)未表达时表现对GANC抗性，而表达时对GANC敏感。1.Introduction⑷FactorsaffectingtheactivityofexogenousDNAA.受体动物的遗传特性同一基因在不同动物活性不同,可能与DNA甲基化次序有关.B.整合位点外源DNA整合位点不同,表达水平不同,差异能达到1000倍.C.内含子(intron)包括内含增强子和普通内含子,都能促进基因的表达.D.基因开关人为调节外源基因的表达,常用基因的诱导表达,基因定点整合技术,或反义RNA技术.2.ProceduresofTransgenicAnimalProduction⑴Reconstructionofexpressionvectors⑵Method