第九章-发酵产物后处理

第九章发酵产物后处理（即下游加工）p39-46本章内容：第一节下游加工过程概论第二节发酵液的预处理和固液分离第三节细胞破碎第四节发酵产物的初级纯化第五节发酵产物的精制第六节成品加工第七节发酵废液的排放目的要求了解发酵产物后处理的意义掌握发酵产物后处理的基本过程掌握发酵产物后处理常见处理方法及原理了解发酵工业废液的特点及其处理的方法几个问题：1、发酵产物后处理的重要性2、发酵产物后处理的一般过程3、发酵产物后处理常用的方法第一节下游加工过程概论一、下游工程二、下游加工的目的及研究意义三、下游工程的特点四、下游加工的基本要求五、下游工程加工的基本流程发酵产物的后处理一、下游工程下游工程:从发酵液或培养液中分离、精制有关产品的过程，称为下游工程。（或下游技术、下游加工过程、或生化分离和纯化过程）。它是由一些化学工程的单元操作组成。由于发酵产品种类繁多，性质各异，其单元操作很多，如蒸馏、结晶、吸附等。二、下游加工的目的及研究意义（一）下游加工的目的（二）下游加工的研究意义（一）下游加工的目的目的：发酵液中杂质含量较多，代谢产物的浓度较低，低浓度的发酵产品不能直接作为工业生产的原料或产品。获得合格生化产品，保证发酵产品的质量和卫生标准，并且不浪费其它有用的物质。必需对需要的生化产品进行分离和纯化等下游加工。发酵产物的产量主要取决于发酵工程的上游技术——菌种和发酵，而其质量、收率和成本则决定于下游工程——提取（初步纯化）和精制。（二）研究的意义1、发酵产物后处理关系到发酵工业的经济效益：在发酵产品的生产中，分离和精制过程所需的费用占成本的很大部分。如传统发酵工业（如抗生素、乙醇、柠檬酸），分离和精制部分占整个工厂投资费用的60%，而对重组DNA发酵、精制蛋白的费用可占整个工厂生产费用的89%～90%。因此，下游加工过程的落后有可能会阻碍发酵工业以及酶、动植物细胞工程的发展。2、下游加工过程的先进与否将关系到整个生物技术产业兴衰。发酵产物后处理的研究开发已逐步成为一个新的和重要的科技领域和产业。许多国家都很重视下游加工过程。3、清洁生产与下游加工技术密切相关。随生物技术产业规模的扩大，废水污染问题越来越突出，它与下游加工技术密切相关。三、下游工程的特点（一）发酵液的特点（二）下游工程后处理技术的特点（三）下游工程目的产物的特点（一）发酵液的特点（p40）1、发酵液大部分是水，一般含水量达到90%～99%，发酵产物浓度较低。2、发酵液中的悬浮固形物主要是菌体和蛋白质的胶状物质。3、发酵液中还有培养基的残留成分，如无机盐、蛋白质、其他大分子杂质及其降解产物。4、发酵代谢副产物，特别是与发酵产物的结构相似。5、色素、热源质、毒性物质等有机杂质。（二）下游工程后处理技术的特点（p40）1、下游工程技术难度大因为，目标成分在发酵液中的含量低，但其他成分的含量和数量都大大超过目标成分，极大的增加了分离工作的难度。2、发酵液是复杂的多相体系有机体、菌体、胶体、固体、液体、细胞内、细胞外。在分离中要充分考虑这些因素。3、目标成分的稳定性较差。因此，要在产物后处理中采用较为温和的分离技术措施。4、由于产品纯度要求高，在分离中损失较大，甚至超过20%。所以寻找新的、特异性强的分离技术是下游加工的趋势。（三）下游工程目的产物的特点（p41）1、一般多为有生理活性的有机化合物，这些物质往往不稳定、易变性、易失活。2、相对分子质量较大。3、目的成分在制备液中的浓度很低，但产品要求的纯度却很高（95%以上）。附加值高。4、含有目的产物的生物制剂中亦含有丰富的营养成分，易被微生物污染和分解。5、成分复杂。6、其目的产物往往参与人体机能的精细调节，任何性质和数量的偏差将造成严重影响。四、下游加工的基本要求1、操作简单费用低。2、提取率高，能够达到要求纯度，废液中最终产品含量低。3、不影响产品质量。4、提取所用试剂对设备腐蚀性小。5、产生废物能够处理，对环境污染少。五、下游加工的基本流程（p41～42）发酵液预处理细胞分离细胞破碎细胞碎片分离初步纯化高度纯化成品加工产物后处理方法胞外产物成品加工高度纯化初步纯化细胞碎片分离细胞破碎细胞分离预处理发酵液提取精制离心、萃取、过滤、错流过滤高压匀浆、珠磨、超声、酶解、化学渗透、渗透压冲击沉降、离心分离，过滤、错流过滤加热、调pH、絮凝沉淀、萃取、离子交换吸附、超滤各种层析、电泳措施无菌过滤、超滤、结晶冷冻干燥、喷雾干燥下游加工的单元操作发酵液的预处理和固液分离初步纯化（提取）•吸附法•离子交换法•沉淀法•溶剂萃取法•双水相萃取法•超临界流体萃取•超滤法高度纯化（精制）•色谱分离•结晶成品加工•浓缩•无菌过滤和去热原•干燥第二节发酵液的预处理和固液分离(p41～43)目的:1）分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒2）除去部分可溶性杂质3）改变滤液性质总之，达到固液分离，提高产物浓度和质量。常用的方法（p41）：调节pH、加热、过滤、离心分离、沉降及倾析等。预处理属于初级分离阶段，主要影响产物的收率。但在某种意义上也影响产品的纯度，因为，如在初级分离中除去大部分杂质，特别是对产品精制有干扰的杂质，将使精制较容易，纯度也提高。一、发酵液的预处理（一）发酵液预处理的目的1．改变发酵液的性质，以利于固液分离。如通过酸化、加热以降低发酵液的黏度，以及加入絮凝剂使细胞或溶解的大分子聚结成较大的颗粒以促进细胞的絮凝。2．分离细胞、菌体或其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质沉淀物）。3．除去部分可溶性杂质和改变滤液以利于后续各步操作。（1）对于胞外产物，应尽可能使目的物转移到液相中，可用调pH至酸性或碱性的方法来达到。（2）对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞。细胞破碎后，目的物被释放到液相中，再将细胞碎片分离。通常，以含有目的物的液相为出发点进行后续提取和精制的各步操作。（二）发酵液预处理的内容1．高价无机离子的去除2．杂蛋白的除去3．菌体细胞和细胞碎片的去除4．色素及其它物质的去除5．调节适宜的pH值和温度二、发酵产物的固液分离固液分离适用于：初级分离、纯化精制。（一）固液分离的目的1．收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相。2．收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物。如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。（二）发酵液常用的固液分离方法与设备主要是离心分离和过滤等化工单元操作。不同性状的发酵液应选择不同的固液分离方法和设备。体积较大：如霉菌和酵母菌，外形尺寸大多在1～10µm范围，其发酵液一般采用高速离心机分离。若对发酵液采用适当的方法进行预处理，则细菌和酵母菌的发酵液也可采用过滤方法进行固液分离。菌体较小：氨基酸的发酵液，采用絮凝和添加助滤剂等方法进行处理后，即可用板框过滤机或带式过滤机进行菌体分离。1、离心分离（1）原理它是借助于离心旋转所产生的离心力的作用，促使不同大小、不同密度的粒子分离的技术。（2）应用十分广泛。如啤酒和果酒的澄清、酵母发酵醪浓缩、谷氨酸结晶分离、各种发酵液的菌体分离和流感、肝炎疫苗及干扰素生产都大量使用各种类型的离心设备。（3）分类按其分离因素（转速）不同可以分为三类：常速（低速）离心机：有工业规模和实验室规模。主要用于收集细胞、菌体、培养基残渣等较大的固体颗粒。高速离心机：用于分离细胞碎片、较大的细胞器、生物大分子盐析沉淀物等较小的固体颗粒。超速离心机：用于生物大分子、细胞器、病毒等分子水平和微粒的分离。2、过滤是传统的化工单元操作，它是借助于过滤介质，在一定压力差的作用下，将悬浮液中的固体粒子截留，而与液体分离的技术。发酵工业中常用的过滤方法与设备：板框过滤机、鼓式真空过滤机（或真空转鼓过滤机）、硅藻土过滤机。不锈钢板框压滤机带式真空过滤机ZGL型燭柱式硅藻土过滤机第三节细胞破碎（p43）细胞破碎：是利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内目标物释放出来的技术。关键：是要选择破碎技术和设备。一、细胞破碎的原因许多发酵产物是胞内产物，分离提取此类产物时，必须将细胞破碎，使产物释放到液相中，才能进行提取和纯化。如谷胱苷肽、花生四烯酸等。一些基因工程产物（胰岛素、干扰素、生长激素等）。某些酶制剂（如青霉素酰化酶、碱性磷酸酯酶等。）植物细胞产物多数为胞内产物。所以基于以上原因要进行细胞破碎。细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤。二、细胞破碎方法（一）化学法酸热法化学渗透法（二）机械法匀浆法研磨法超声波法球磨破碎法（三）其它破碎方法冻结－融化法（亦称冻融法）干燥法酶溶法细胞碎片的分离方法：离心分离法、两水相萃取法。三、破碎率的测定检测细胞破碎效果的方法：（一）直接测定法（二）目标产物测定法（三）导电率测定法（一）直接测定法破碎前的细胞：可利用显微镜或电子微粒计数器直接计数。破碎后的细胞：用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别开来，便于计数破碎后的完整细胞。如破碎的革兰氏阳性菌可染色成革兰氏阴性菌的颜色。采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，未损害的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。（二）目标产物测定法细胞破碎后，通过测定破碎液中目的产物的释放量来估算破碎率。通常是将破碎后的细胞悬浮液用离心法分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。（三）导电率测定法细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升，并且它随破碎率的增加而呈线性增加。四、细胞破碎技术的发展方向（一）多种破碎方法相结合如机械法和非机械法结合可起到“取长补短”的作用。（二）上游过程相结合1.在上游细胞培养过程中，通过改变培养基成分，生长期或操作参数（pH、温度、通风量、释放率等），使细胞破碎变得容易。2.通过基因工程手段对菌体进行改造，以提高胞内物质的提取率。（三）与下游过程相结合细胞破碎后的固液分离常很困难，除了应从后步分离过程的整体来考虑破碎条件（如细胞碎片不能太小）外，还可将破碎操作技术直接与纯化过程结合起来。第四节发酵产物的初步纯化发酵液经固液分离或细胞破碎及碎片分离后，滤液体积很大，活性物质浓度很低。下游加工过程就是浓缩和纯化过程。第一步称为初步纯化或提取，主要目的在于浓缩，也有纯化作用。后几步的操作处理体积小，称为高度纯化或精制。初步纯化（提取）：除去与目标产物性质有很大差别的物质。方法：蒸发、吸附法、离子交换、沉淀、萃取、膜过滤等。特点：这些分离过程不具备特异性，只是进行初分，只是提高产物浓度和质量，但纯度不高。目的：在此阶段各种不需要（与产物性质差异较大）的介质被分离（即除杂质），目的产物的浓度将大大提高。发酵产物初步纯化常用的方法（p43-44）一、吸附法二、离子交换法三、固相析出分离法（如沉淀法）四、溶剂萃取法五、膜过滤法一、吸附法应用：抗生素等小分子物质的提取。吸附剂：活性炭、氧化铝、离子交换剂、大孔树脂等。二、离子交换法应用：小分子物质的提取。酸性或碱性离子交换树脂。三、固相析出分离法改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术称为固相析出分离法。析出物为晶体时称为结晶。析出物为无定形固体称为沉淀法。固相析出法：盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法等。沉淀法主要用于蛋白质的提取，主要起浓缩作用。盐析法:当加入的中性盐达到一定浓度时，使水活度大大减小，同时中性盐的解离中和了蛋白质表面的电荷，破坏了蛋白质表面的水化层，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质互相聚集而沉淀。常用的是硫酸铵。用量：饱和度达到20-60%等。应用：蛋白质的沉淀分离。常用的蛋白质盐析方式有两种：K盐析：固定蛋白质溶液的pH值和温度，变动其离子强度，常用于蛋白质粗品的分组沉淀；ß盐析：在一定离子强度下，改变pH值或温度