凝胶电泳技术

凝胶电泳技术电泳（electroghoresis）：带电物质在电场中向相反电极移动的现象。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。电泳的基本原理：在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。F＝QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。为了获得好的电泳结果，应尽量减少电荷效应，增加分子筛效应。常用的凝胶电泳有两类：琼脂糖凝胶电泳：分辨率稍低，适于较大分子。聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨率高，适于较小分子。一、影响凝胶电泳迁移率的因素（一）样品的物理性质1、分子大小线状双链DNA分子长度（碱基对数目bp）的对数（log10）与迁移距离成反比，以此来测定DNA片段（线性双链）的分子量准确且方便。EB嵌合使迁移率下降15%。当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。2、分子的空间构型：即使分子量相同，构型不同，其迁移率也不同。DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：共价闭合环状DNA（covalentlyclosecircularDNA，cccDNA，超螺旋构型）＞lDNA（linearform，线型，质粒的两条链均断裂；线性分子）＞ocDNA（开环DNA，opencircularDNA，ocDNA，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口）。但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。3、带电量：核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。4、碱基组成：对迁移率影响不明显，单链DNA形成发头结构，影响迁移率，单链（1kb）小于双链DNA（1kb）(二)支持物介质（种类和浓度）核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成，其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。凝胶浓度浓度越小，孔径越大，浓度越大，孔径越小。不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围浓度%（W/V）线状DNA分子的有效分离范围（kb）0.35－600.61－200.70.8－100.90.5－71.20.4－61.51.2－32.00.1－2DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围聚丙烯酰胺浓度有效分离范围（bp）二甲苯青FF溴酚蓝3.51000－20004601005.080－500260658.060－4001604512.040－200702015.025－150601520.06－1004512（三）电场强度电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。1-5V/cm（低压），低压时，线性DNA迁移率与电压成正比，而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小。高电压影响凝胶的分离范围，使分辨率下降：因为随电压上升，不同长度DNA泳动的增加程度不同，凝胶有效分离范围随电压上升而下降。高压电泳（20-600V/cm（电场强度）,1000-2000V（电压））,必须用PAG作介质。（四）电泳缓冲液（种类、pH、离子强度）1、pH值：决定带电颗粒的解离程度，缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。2、离子强度：离子强度小，溶液的导电性小，带电颗粒泳动慢；离子强度大，溶液的导电性高，带电颗粒泳动快（过高，产生大量热，胶熔化，或使DNA变性。3、种类：TAE（Tris、醋酸、EDTA）：缓冲能力差，电流大易发热，长时间使用阴极为碱性，阳极为酸性，需要循环使两极的pH一致；但价格便宜。TBE（Tris、硼酸、EDTA）：缓冲能力强。首选TBE。TPE（Tris磷酸，EDTA）：缓冲能力强，但回收DNA易与DNA一起沉淀，影响酶反应。TNE（Tris醋酸钠，EDTA）：电流大，适合于长时间低压电泳，分辨率高。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。TBE一般配10×或5×的贮存液，都以1×TBE作为使用液进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量；进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液或高压灭菌。DNA电泳带糊的原因：1)DNA降解，应避免核酸酶污染；2)电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液；3)所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力；4)DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量；5)DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐；6)有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白；7)DNA变性电泳前勿加热，用20mMNaCl缓冲液稀释DNA。二、核酸电泳的指示剂与染色剂核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，二甲苯青的迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液（loadingbuffer）。载样缓冲液的作用：①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内；②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置；③使样品呈色，使加样操作更方便。配方：将0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF或分别，或同时加入或30%甘油水溶液，或40%（W/V）蔗糖水溶液，或15%聚蔗糖(Ficoll400)中。（二）染色剂核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色，目前还有其他不仅安全的染色剂。溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）最常用260nm，300nm，360nm，发出590nm橙红色。溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的NDA条带。溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。最低检出量100ng染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量DNA（小于10ng）片段时，通常要将染色后的凝胶进行脱色。EB存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定），凝胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。EB在凝胶或染色液中的浓度为0.5g/ml或0.1g/ml。注意：EB见光易分解，应存棕色试剂瓶中于4℃下保存。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！核酸吸收260nm紫外线，导致DNA的断裂，因此回收DNA应在长波紫外线下观察较好，以减少对DNA的损伤。荧光易淬灭，注意观察的时期，不要反复在紫外下照射。由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。(1)对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理：①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml；②加入一倍体积的0.5mol/LKMnO4，混匀，再加入等量的25mol/LHCl，混匀，置室温数小时；③加入一倍体积的2.5mol/LNaOH，混匀并废弃。（2）EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理：①按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时；②用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。银染：银染色液中的银离子(Ag)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。EB的替代物：GoldViewDNA染料是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，使用方法与之完全相同。采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA时，GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，在某些波段甚至超过EB。在100ml琼脂糖胶溶液中加入5μlGoldView即可，亦可在电泳缓冲液中以同样比例稀释后直接使用。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链多聚核酸链呈红色荧光。因此，GoldView不仅能染双链DNA，也可用于染RNA和单链DNA。GoldViewDNA染料在不同的波长下灵敏度有一定影响，建议使用312nm波长。弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般5-10min条带就会消失。GeneFinder具有安全、灵敏等突出优点，可以代替溴化乙锭(EB)作为各种核酸电泳的染色剂。与强致癌性的EB不同，GeneFinder?属于花青类染料