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-15分子生物学研究法（上）6——DNA、RNA及蛋白质操作技术7从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，除了基础理论的重大突破，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。-2基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心与基本技术。-3基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。-4基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。-5-65.1重组DNA技术回顾三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质——解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制——解决了基因的自我复制和世代交替问题；-7第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码——阐明了遗传信息的流动与表达机制。-8表5-1重组DNA技术史上的主要事件年份事件1869FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1959-1960Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一个遗传密码；Jacob和Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。1964Yanofsky和Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。-91966Nirenberg，Ochoa，Khorana，Crick等人破译了全部遗传密码。1967第一次发现DNA连接酶1970Smith，Wilcox和Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶，Temin和Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973Boyer，Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977Sanger与Maxam和Gilbert等人发明了DNA序列测定技术，1977年完成了全长5387bp的噬菌体φx174基因组测定。1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。1981Palmiter和Brinster获得转基因小鼠，Spradling和Rubin得到转基因果蝇。1982美、英批准使用第一例基因工程药物——胰岛素，Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。-101983获得第一例转基因植物。1984斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1986GMO首次在环境中释放。1988Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠—“Oncomouse”。1992欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定（(1.15×108bp)。2001完成第一个人类基因组全序列测定(2.7×109bp)。-11限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端或平端的小片段。（1）限制性核酸内切酶-12图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。-13图5-2DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a.DNA的粘性末端;b.DNA的平末端;c.化学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。（2）DNA连接酶-14仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。（3）分子克隆的载体-15图5-3重组DNA操作过程示意图-16目的基因的表达-17-18-19-20-215.2DNA基本操作技术5.2.1核酸凝胶电泳技术自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。-22一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。-23生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。-24琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。-25表5-2琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1-26在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidiumbromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。-27溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。-28图5-4溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。-29-305.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。-31转化(transformation)特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染(transfection)是指噬菌体、病毒或以它作为载体构成的重组子导入细胞的过程。转导(transduction)以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程。上述概念往往容易混淆。-32转化是一个自然存在的过程。细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被λ噬菌体DNA感染，随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也可进入细菌。-33转化原理：将快速生长中的大肠杆菌置于经0℃预处理的低渗氯化钙溶液中，使细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，易与外源DNA相粘附并在细胞表面的复合物。42℃下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子。细菌转化及蓝白斑筛选：图5-5-34图5-6λ噬菌体可以作为克隆载体-35重组DNAAmprTcs提取DNA电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转化无菌落阳性菌落筛选重组子2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切-365.2.3聚合酶链反应技术（PCR）首先将双链DNA分子加热分离成两条单链，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种dNTP合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（“引导”）新链的合成，所以，新生DNA链的起点由寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点所决定。-37由于在PCR反应中所选用的一对引物，是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝相反方向延伸的。-38整个PCR反应的全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA相结合（退火）、DNA合成（链的延伸）三步，可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。-39图5-8PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较。-40主要步骤：将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。-41然后降低反应温度（约50℃），致冷1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。-42最后，将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链。-43聚合酶链式反应示意图。（a）起始材料，双链DNA；（b）反应混合物加热后发生链分离，降温使引物结合到待扩增靶DNA区段两端的退火位点上；（c）Taq聚合酶以单链DNA为模板在引物的引导下利用反应混合物中的dNTPs合成互补的新链DNA；（d）将反应混合物再次加热，使旧链和新链分开；（e）合成新的互补链DNA；（f）重复b；（g）重复c、、、、、、-44引物设计一般遵循下列原则：(1)引物长度以15~30bp为宜。(2)引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45~55%左右。(3)引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3'末端不应有互补链存在。(4)引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。(5)引物3‘末端碱基:原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。(6)引物5'末端碱基:PCR反应物5'末端碱基并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其5'末端碱基可以不与模板DNA匹配而呈游离状态。-45PCR反应引物设计:PCR作为一个体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面:一是引物与模板的特异结合二是多聚酶对引物的有效延伸基因组DNA作为模板时，由于其数量的庞大及结构复杂，除了特异扩增外，往往很容易产生非特异性扩增产物。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。-465.2.4实时定量PCR（Realtime-PCR）普通PCR扩增产物总量变化大。实时定量PCR技术：利用带荧光检测的PCR仪对PCR过程DNA累积作出动态监测。荧光染料：SYBRGreenI：图5-9TaqMan探针：图5-10-475.2.5基因组DNA文库构建基因组DNA文库构建