WB实验步骤

蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳）实验材料：SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGELoadingBuffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水实验仪器、耗材：蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用）配制溶液：配制10%APS溶液：-20度保存0.5gAPS+5ml蒸馏水、2.5gAPS+25ml蒸馏水配制200ml电泳缓冲液：CW0045Tris-GlycineSDS（ph8.3,10×）20mlTris-GlycineSDS+180ml蒸馏水配制1mlloadingbuffer：200ul5×loadingbuffer+800ul蒸馏水实验步骤：一．制胶：1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。SDS-PAGE分离胶的浓度与最佳分离范围SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD3.配制10%分离胶：将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。配制SDS-PAGE分离胶分离胶浓度凝胶体积所需各组分体积（单位：ml）双蒸水30%Acr-Bis(29:1)分离胶缓冲液（4×）10%APSTEMED10%5ml2.081.671.250.050.00210ml4.173.332.50.10.00415ml6.255.03.750.150.00620ml8.36.750.20.0084.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟至1小时。5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。6.配制5%浓缩胶：配制5%SDS-PAGE浓缩胶凝胶体积所需各组分体积（单位：ml）双蒸水30%Acr-Bis(29:1)浓缩胶缓冲液（4×）10%APSTEMED2ml1.140.340.50.020.0024ml2.280.6810.040.0046ml3.421.021.50.060.0068ml4.561.362.00.080.0087.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。注意：灌胶速度要快，防止凝胶。8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。二．SDS-PAGE电泳:1.在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。2.制备样品：1）蛋白样品：根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。蛋白提取液+5×上样缓冲液+蒸馏水，上样量为40-60ug。制备的样品，煮沸5分钟，12,000rpm离心5分钟，取上清，上样。3.上样：蛋白上样顺序如下：泳道12345678910样品Marker样品1样品2样品3样品4样品5样品6样品7样品8样品9体积10μl20μl20μl20μl20μl20μl20μl20μl20μl10μl4.电泳：浓缩胶80V，约20分钟，分离胶100V，约1小时。一、考马斯亮蓝染色注：将提取的植物蛋白进行电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色。全细胞裂解液电泳后，进行westernblot检测。1.将电泳后的PAGE胶取出放入容器中，加入适量蒸馏水（以充分覆盖PAGE胶为宜），加热至沸腾后5分钟，弃去蒸馏水；2.加入适量考马斯亮蓝染色液（液面覆盖凝胶即可）加热至沸腾后5分钟，弃染色液；3.加入适量蒸馏水，加热至沸腾后5分钟，弃蒸馏水，重复此步骤至背景清晰。4.观察拍照。WesternBlot溶液配制：配制500ml1×TBST溶液：50mlTBST（ph8.3,10×）+450ml蒸馏水配制100ml5%牛奶封闭液：4度保存5克脱脂奶粉+100ml1×TBST配制100ml转膜缓冲液（甲醇）：CW0044Tris-Glycine（ph8.3,10×）10mlTris-Glycine+20ml甲醇+70ml蒸馏水（4度保存）一．转膜及染色实验材料：NC膜、滤纸、转膜缓冲液、丽春红染色试剂、水平摇床实验仪器、耗材：转膜仪实验步骤：1.电泳完成后，小心打开玻璃板，去除浓缩胶，将分离胶剥离后，放入转膜缓冲液中平衡。2.用剪刀剪相同大小的NC膜及滤纸，放入转膜缓冲液中平衡。3.转膜：（半干转）1）将平衡好的3层滤纸平铺于转膜槽底部。滴加转膜液润湿。2）将胶平铺在滤纸上，赶平去气泡。3）将平衡好的NC膜平铺在胶上，用玻璃棒赶平，确保膜与胶之间没有气泡。4）再将3层滤纸平铺于膜上，赶平。5）盖好转膜槽上盖，压紧。插上电极，50mA/膜，转膜1小时。转膜：（湿转）150mA/膜，转膜1.5小时4.丽春红染色1）将转移后的膜完全浸入丽春红染色液中，摇动3-5分钟。2）蒸馏水漂洗膜2-3次，直至膜上出现清晰条带。3）再次用蒸馏水漂洗，去除染料。二．封闭实验材料：5%脱脂奶封闭液实验步骤：用封闭液将膜室温封闭1小时三．抗体检测：检测β-actin，分子量43KDa实验材料：5%脱脂奶封闭液、抗β-actin鼠单克隆抗体、山羊抗鼠IgG（H+L）HRP、TBST实验步骤：1.在6ml5%的脱脂奶中加入2μl抗β-actin鼠单克隆抗体（稀释度为1:3000）。2.将膜浸入到一抗稀释液中，室温孵育1小时，或者4℃孵育过夜。3.TBST漂洗7次，每次5分钟。4.在10ml5%的脱脂奶中加入2μl山羊抗鼠IgG（H+L）HRP（稀释度为1:5000）。5.将膜浸入到二抗稀释液中，室温孵育1小时。6.TBST漂洗7次，每次5分钟。四．显影实验材料：DAB显色液实验步骤：1.将试剂A和B以1:19的体积比混匀后即为DAB显色工作液。2.将配制好的DAB工作液滴加到印迹膜上，孵育1-5分钟，显色。3.将膜放入蒸馏水中，终止反应。