PCR污染的产生及防治

.PCR污染的产生及防治.PCR实验室污染的特点•概念：由于各种原因，造成的PCR扩增体系中出现了非目的检测样本本身的模板，使得PCR结果出现假阳性。•PCR实验室的污染不同于一般生物安全实验室的污染•PCR污染总是产生假阳性结果.PCR流程•样品准备（samplepreparation）•反应体系配置（PCRreactionassembly）•PCR反应（PCRexecution）•反应后分析（post-PCRanalysis）.PCR污染的途径•操作错误或者误差造成的样品间交差污染•PCR试剂的污染•PCR实验器材的污染•气溶胶（AmpliconAerosol）.PCR污染的四种来源•标本或模板间的交叉污染•PCR试剂的污染•PCR扩增产物的污染•实验室克隆质粒的污染.引起PCR污染的原因标本或模板间交叉污染•容器被污染•标本或模板放置时,由于密封不严溢于容器外•容器外粘有模板而造成相互间交叉污染•标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染•模板吸取过程中,因气溶胶（aerosol）或其他原因引起移液器污染，从而导致交叉污染•有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.引起PCR污染的原因PCR试剂污染•PCR试剂配制过程中,移液器、容器、水及其他溶液等原因造成试剂被PCR核酸模板污染。.引起PCR污染的原因PCR产物污染-最主要最常见•PCR产物拷贝量大(一般为10^13拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限。极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。•移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCRmix•PCR产物的气溶胶污染：据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.※气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中粒径一般为0.001μm~1000μm的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可形成气溶胶.引起PCR污染的原因实验室中克隆质粒的污染•在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见•克隆质粒在单位容积内含量浓度高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.PCR污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染，是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.•PCR强大扩增能力+检测的敏感性•经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍•极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题NTC(NoTemplateControl):必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反应。.对照试验•1.阳性对照:它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大，操作时需注意防止交叉污染。•2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照，它包括①阴性标本对照（NTC）:被检的标本是血清，就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂空白对照（Blank）:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。•3.重复性试验•4.选择不同区域的引物进行PCR扩增.污染的预防进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。主要涉及：（1）划分操作区（2）分装试剂（3）实验操作注意事项.划分操作区－－理想的PCR实验室分区.污染的预防－－分装试剂•PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。•所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA。•无污染的试验器材•无污染的消耗品•PCR用水应为高压的双蒸水。•引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制。•引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。.污染的预防－－实验操作注意事项•尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：1.在准备样品时，着清洁的工作服和手套，切忌着已污染过PCR产物的工作服和手套；2.戴一次性手套，发现手套有污染时应立即更换手套；实验完成后离开所工作场所时，脱掉手套，放置在专用垃圾桶中；3.使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；4.准备专供自己使用的PCR试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起；.污染的预防－－实验操作注意事项5.开管动作要轻，以防管内液体溅出。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；所有含质粒模板和PCR产物的EP管开盖前高速离心1-3分钟；6.最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；7.操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；8.由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；.污染的预防－－实验操作注意事项9.禁止把PCR产物带到配制PCR体系的场所；禁止在配制PCR体系的场所操作质粒和含克隆质粒的菌液；10.在从有盖的容器中取样时，把盖子拿在手中，或者确保它放到清洁和不会污染周围环境的地方。11.尽量保证反应体系和试剂在一个密封的容器中；12.PCR反应完成后，尽量减少打开密封反应体系的机会；如必须打开，应在独立专用房间内打开；13.实验结束后或定期清洁工作台面和仪器。.污染的预防－－移液器操作移液器操作由于操作时不慎将模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样时要十分小心。1）准备PCR的移液器专用2）吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污染或产生气溶胶污染。3）最好在加完所有其他反应成分后才吸加模板。4）推荐在准备PCR过程中使用滤芯枪头.污染的预防－－首要原则•永远要设置NTC对照如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的后果：一大段时间的数据不可信•准备PCR的移液器要专用千万不能用吸取PCR产物/克隆质粒的移液器去准备PCR体系.追踪污染源－－设立阴阳性对照•有利于监测反应体系各成分的污染情况。•选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。•此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。.追踪污染源－－环境污染•在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。•环境污染中常见的污染源主要有：1.加样器；2.电泳装置；3.切胶用刀或手术刀片；4.离心机；5.冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；6.气溶胶。.•选用含UNG（尿嘧啶DNA糖基酶Uracil-N-Glycosylase)的试剂，有助于防止PCR产物引起的污染。UNG：50摄氏度，2分钟，作用于含有dU的DNA双链或单链然后开始PCR反应的预变性步骤，同时UNG失活使用UNG酶控制污染※对于不含dU的PCR产物无效污染处理－－反应液污染.•问题：•－－PCR产物越长，该方法效率越高，小于100bp的产物，效果不很完全；•－－影响PCR扩增效率；•－－UNG酶的活性保存非常重要；•－－UNG酶的造价不低，每一检测人份的费用上升比较明显。.污染处理－－环境污染•稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；•紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。.谢谢！