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实验一实验基本操作2020/10/29基本操作及植物内生菌分离•培养基配制•高压蒸汽灭菌•接种•培养•基本鉴定•保藏•抑菌试验2020/10/29一.培养基配制•基本营养物质：碳源、氮源、水、无机盐•特殊成分：维生素•注意：充分考虑微生物自身及生存的环境：pH（细菌偏碱，真菌偏酸）、盐度、碳源等；含糖培养基于115oC灭菌；抗生素过滤除菌。2020/10/29培养基配方真菌：1.马丁培养基：蛋白胨5g；酵母浸出粉2g；葡萄糖20g；K2HPO41.0g；MgSO4·7H2O0.5g；琼脂18g；水1000mL。灭菌冷却至60度时，添加终浓度为100μg/ml的青霉素溶液。放线菌：2.M1培养基可溶性淀粉10g；酵母浸出粉4g；酪蛋白胨2g；琼脂18g；水1000mL。同时添加终浓度为50μg/ml的重铬酸钾溶液。2020/10/29•电子天平•使用说明：•轻推玻璃箱门，放上称量纸，调零；•待显示的数字稳定后，取药勺逐量添加待称药品；•关闭玻璃箱门，待数字稳定后取出药品；•关上玻璃箱门，天平归零。••注意事项：•每次用完后用毛刷或纸巾清理电子天平，不可在天平内残留样品，以防腐蚀仪器；•称量时，如果显示数字不稳定，可关闭窗户和空调；•配制培养基时如需称量较大体积的材料应采用圆型玻璃板不宜用称量纸；•每次使用的称量纸都是一次性的，用后扔掉，称量后的药勺需要清洗。2020/10/29二、高压蒸汽灭菌•1.使用说明：•检查灭菌锅中的水量，添加蒸馏水至水位漫过电阻丝，接通电源；•将待灭菌物品放置在锅内，盖好内仓的盖子；•打开开关，设定灭菌温度和时间，常规灭菌温度为121℃，时间为15～20min，含糖或不稳定物质的灭菌温度为115℃，时间为20～30min最后再按一下椭圆箭头确定条件；•检查灭菌锅的胶圈是否放置平稳，顶盖旋入内仓盖的正上方，用力旋紧锅盖，保证不要漏气而无法升压；•加热过程为自动进行，但在灭菌过程中仍需监视运作是否良好；•到设定时间后，锅会自动鸣叫，观测气压降低到正常水平后，方可旋开锅盖，取出物品，完成灭菌，关闭电源。2020/10/29•注意事项•检查夹套中水量是否符合要求，排水筒内的水请及时清理以防倒吸；•物品不易过多，以免无法盖严内仓盖；•用瓶塞封口的容器，应在盖子上夹一个纸条，保证灭菌时气流通过；•容器内有液体的，不可超过容积的1/3，报纸包的培养皿等不能放在下层，以防潮湿；•灭菌完成后等压力读数回零后再取出；•灭菌过程中出现低水位的情况或者漏气严重，无法升压的情况，应该采取关掉灭菌锅，等压力降低到正常后重新开锅灭菌；•在压力上升过程中，应有人看管避免气压上升超过对应的温度，最后超过警告压力，自动放气报警。2020/10/29灭菌耗材•1、马丁培养基•2、M1培养基•3、0.8%生理盐水250ml•4、200uL,1000ul枪头•5、培养皿：4个/组（含棉花)1个/组•6、试管6个/组•7、研钵1个/组2020/10/29植物内生菌分菌流程处理去除外表微生物保护内部微生物超声0.8%无菌生理盐水(30s)75%乙醇(3-5min)无菌水（3-5次）无菌棉吸干(要潮不能湿)内部微生物的释放切碎（撒植物）——研磨——稀释（10-3涂布）三、接种1.接种前:开启无菌超净台紫外灯30min，过长臭氧浓度过高且易损灯管；含抗生素平板不宜放在紫外灯下。2020/10/29倒平板温度约50℃防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基2.接种⑴平板划线法：菌种接种环防止划破培养基2020/10/292.接种分段划线法2020/10/29常用于菌种分离纯化2020/10/29常用于扩大纯种菌种及实验室保存菌种连续划线法2020/10/29点接法常用于扩大培养丝状真菌接种注意事项•1.各区之间接种环要灼烧。•2.用力适当，不要划破琼脂表面。•3.火焰上方无菌操作。2020/10/291ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：菌液2020/10/29稀释103倍稀释104倍稀释105倍⑵稀释涂布平板法：b.涂布平板：滴、灼、试、涂不超过0.1ml滴灼试涂四、培养•注意：温度时间培养皿先正置1-2小时，后倒置。2020/10/292020/10/29摇床1．使用说明：1)使用仪器前,先将调速旋钮置于最小位置,开关“振荡开关”。2)装培养瓶。为了使仪器工作时平衡性能好，避免产生较大的振动，装瓶时应按从下到上，从中间到两边，左右前后对角对称分布的原则，将所有瓶位布满，各瓶的培养液应大致相等。若培养瓶不足数，可将瓶对称放置或装入其它等量溶液的瓶布满空位。打开振荡开关，设置所需的转速。在转速范围内中速使用，可延长仪器的使用寿命。2020/10/292．注意事项：1)培养瓶需标明培养物名称、接种时间和接种人姓名；2)因使用频率高，紧固培养瓶的钢圈常会松动，请在每次放瓶时检查并加紧，以防震荡过程中瓶子破坏；3)工作区域不能存放不必要的用品，保持工作区的清洁；4)仪器在连续工作期间,每三个月应做一次定期检查：检查是否有水滴、污物落入电机和控制元件上；清洁轴流风机上的灰尘；检查保险丝；控制元件及紧固螺钉；5)传动部分的轴承在出厂前己填充了适量的润滑脂(1号钙-钠基)，仪器在连续工作期间，每六个月应加注一次润滑脂，填充量约占轴承空间的1/3。2020/10/29恒温培养箱1.使用说明：1)打开箱门，将待处理物件放入箱内搁板上，关上箱门；2)接通电源，此时仪表出现数字显示，表示设备进入工作状态，通过操作控制面板上的温度控制器，设定所须要的箱内温度，仪器开始工作，箱内温度逐渐达到设定值；3)使用结束后关闭电源，待箱内温度接近环境温度后，打开箱门，取出样品。2020/10/292.注意事项：1)通常真菌放在28度培养箱内，细菌放在37度培养箱内，培养皿放置在培养箱内时，请将长菌的一面朝上，同时用保鲜膜把培养皿封口或者方便袋打包以防止交叉污染；2)开关门时尽量轻点，防止碰翻培养皿或者把孢子带出来。恒温培养箱旁的保种冰箱里的试管要标明品种、日期，管口朝里以防霜冻；3)可燃性和挥发性的化学物品切勿放入箱内；4)如在使用过程中出现异常、气味、烟雾等情况，请立即关闭电源，用户切勿盲目修理，由专业人员查看修理；5)箱壁内胆和设备表面要经常檫拭，以保持清洁，增加玻璃的透明度。请勿用酸、碱或其它腐蚀性溶液来檫拭外表面；6)设备做停机不用时应驱潮处理，具体方法如下：将箱内底部接水盘的水倒掉，将温度设定在42℃，运行5小时，并每隔二小时开一次箱门放掉潮气，处理完毕后拔掉电源插头存放；7)设备长期不用，应拔掉电源线以防止设备损伤。四、基本鉴定•形态观察•分子生物学16srDNA•生理生化2020/10/29结晶紫1’碘液1’95%乙醇30”复红1’冲洗滤纸干燥油镜观察冲洗冲洗冲洗染色初染媒染脱色复染五、菌种保存常见方法1、临时保藏：琼脂斜面低温保藏法2、长期保存：甘油冷冻管藏法冻结真空干燥保藏法菌种管上应标明菌种编号、代次、培养条件、接种日期、接种人姓名。菌种入库。27琼脂斜面低温保藏法1、细菌置4～6℃保藏，芽孢杆菌每3～6个月移植一次，其他细菌每月移植一次。2、放线菌于4～6℃保藏，每3个月移植一次。3、酵母菌于4～6℃保藏，每4～6个月移植一次。4、丝状真菌于4～6℃保藏，每3个月移植一次。5、担子菌于4～6℃保藏，每3个月移植一次。6、保藏的湿度通常在50％～70％为宜。7、传代不可超过5代。冻结真空干燥保藏法•备安瓿管→备脱脂乳→制菌悬液→分装→预冻→真空干燥→封管保藏•10年以上2020/10/29棉塞熔封区放标签处装液区外管熔封区棉塞内管放标签处变色硅胶棉塞六、抑菌试验•稀释法•平皿法2020/10/29增殖率实验组（校正）对照组（校正）control0.00%稀释1:10.01650.021稀释1:1-21.43%稀释1:20.00650.0115稀释1:2-43.48%稀释1:40.00150.0045稀释1:4-66.67%稀释1:80.0010.001稀释1:80.00%稀释1:160.002-0.0005稀释1:16-500.00%注：放于37℃摇床2h2020/10/29平皿法被抑制菌XX菌XX菌XX菌XX菌立枯丝核菌禾谷镰刀菌大肠杆菌实验结果记录：发酵液体积记录、抑菌直径（mm）记录样品2020/10/29谢谢2020/10/29