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石蜡切片免疫组织化学操作流程一、组织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例）1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为350mg/kg动物体重，常用麻醉药物浓度为5%、6%、7%、10%（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率相应较高，本人使用7%浓度，若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）；动物麻醉后，将其固定于灌流操作平台，仰卧位；2.动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）；固定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意）3.动物灌流：C57小鼠25-30g左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液流出：吊瓶灌流——以生理盐水50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min（时间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%多聚甲醛进行灌流，约100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——生理盐水50ml快速推注，后换用4%多聚甲醛50ml缓慢推注。灌流成功的标志——灌流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；换用4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。4.开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况）5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分）6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜二、组织石蜡包埋7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片）本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下：自来水冲洗完成→50%乙醇25min→70%乙醇25min→80%乙醇25min→90%乙醇25min→95%乙醇I10min→95%乙醇II15min→无水乙醇I10min→无水乙醇II15min→二甲苯I15min→二甲苯II15min8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备合适体积的石蜡液体，以组织块完全浸没其中为宜）；将透明完成的组织块，尽量沥干多余二甲苯，迅速转入1号烧杯的石蜡液体内（避免包埋窗内产生气泡，气泡若围绕组织块会影响浸蜡过程），依次将所有组织块迅速转入其中，要求组织块要全部浸没在石蜡中，流程如下：1号石蜡2h→2号石蜡2h→3号石蜡2h在每个阶段的浸蜡过程中，可根据时间安排适量的延长浸蜡时间，但尽量不要减少时间9.组织块包埋：包埋前，准备沸水备用；清理干净包埋槽备用；包埋开始时，将装有组织块的烧杯浸入沸水中，防止在包埋过程中，烧杯中的石蜡凝固，具体操作如下：1）用镊子夹取包埋槽在酒精灯预温，控制包埋槽的温度不要过高；2）将烧杯内的石蜡倒入包埋槽内，液面高度刚好没过包埋槽两侧平台3）取出浸泡的组织块，用小镊子过火后夹取组织块放置在包埋槽的凹陷处中心部位，根据切片要求摆放位置，注意在放置过程中避免组织块下面接触包埋槽底部的位置产生气泡，通常在放置前，可将组织块浸没在凹槽内的石蜡中翻滚，使其各面均匀接触石蜡液体，然后放置在正确的位置（此时假如包埋槽预温过高，则会导致组织块在接触槽底面后异常干燥，在整个蜡块凝固后会在干燥处出现凹洞，不利于石蜡块的长期保存）；4）将包埋窗轻轻放置在包埋槽的平台上面，尽量保证两侧高度相同，此时槽内之前的石蜡会浸没部分包埋窗的格栏，静置1-2min（避免倒入热的液体石蜡后，石蜡从包埋窗的边缘流出）；5）静置后，石蜡表面会出现凝固表层，此时再用烧杯中的石蜡填充包埋窗的凹陷处以及靠近边缘的条状凹洞，液面稍高于包埋窗边缘（靠近边缘的条状凹洞一定注意填充石蜡，关乎整个蜡块凝固后与包埋窗结合的紧密程度；石蜡凝固后体积会缩小，避免因液面过低导致的后期包埋窗内部支撑不够）6）静置至少30min，可将包埋后的蜡块从包埋槽内分离（注意分离时，应先清理包埋槽四周的多余石蜡，露出包埋窗与包埋槽接触的边缘，然后从一个角将蜡块撬离包埋槽）三、石蜡切片10.准备工作：蜡块的修整——将组织周边的石蜡在保留操作位置的情况下尽量去除（1-减少石蜡块切面与刀片的接触面积，便于受力均匀，易切出完整切片；2-石蜡切面与刀片接触面积小，会减少刀片接触到蜡块中坚硬杂质的几率，增加刀片的使用寿命；3-接触长度减少，可增加刀片使用次数，通常情况下至少多使用1次）准备器材：40度恒温水浴（温度控制在40-42之间的恒温状态，此温度可使蜡片较长时间保持切片形态，温度较低切片不易展开，温度较高，切片会在短时间内融化，易造成组织变形）切片刀片、包被载玻片、弯镊、毛刷、铅笔、切片盒冰盒（通常情况不需要，在组织脱水透明严重，切片呈粉末状态时，可用冰块冰敷石蜡切面，在短时间内可改善切片表面状态，能够帮助切出3-5片完整切片，只有在前期处理出问题时才使用进行一定程度挽救）切片大致流程：1）安装刀片；将蜡块固定于切片机上，调整蜡块表面与刀片距离，矫正蜡块表面与刀片切线平行；2）调整切片模式为trim-10um进行表面找平，并观察切片状态，调整蜡块角度，使切片左右对称，同时注意观察目标区域出现位置；3）切片调平，并出现合适目标区域，调整切片模式为sect-5um进行切片，获取所需组织切片样本；4）将完整合适的切片，夹取至水浴锅内摊平，左手持载玻片，右手持弯镊辅助，将切片贴于载玻片中，放置在水浴锅边缘进行干燥并做好相应标记；5）将干燥完成切片，按照样本分类放置在一起收于切片盒中备用6）切片完成，清理清片机；剩余组织蜡块，需要在切面表面均匀涂抹融化的石蜡，避免组织块直接与空气接触（不进行封闭，会使组织块在长期的暴露过程中，含水量发生变化，易于与支撑蜡块分离，造成后续再次切片困难）7）切片盒中切片，干燥后可在室温下长期放置，推荐切片完成后及时进行后期组织染色或组织免疫化学孵育。四、石蜡切片免疫组化11.选取合适的组织切片（需要根据实验目的选取，如本实验中需要观察不同分组内海马部位相应位置病理改变，则切片选取时需满足左右海马结构形态大致相当，不同分组间切海马的大小及在脑部大致位置相当），置于切片架放于60度烘箱内，烘烤2h（目的在于融化载玻片上的石蜡）12.切片脱蜡、梯度复水：烘烤完成后，将切片迅速置于备好的二甲苯玻璃缸内（一定要用玻璃缸盛放二甲苯）进行脱蜡复水，具体流程如下：二甲苯I10min→二甲苯II10min→无水乙醇I5min→无水乙醇II5min→95%乙醇5min→90%乙醇5min→80%乙醇5min→70%乙醇5min→50%乙醇5min→蒸馏水5minX3建议在梯度酒精过程中不要省略梯度，因为梯度跨越较大时易导致脱片13.微波抗原修复：准备枸橼酸盐缓冲液，调至pH6.0备用将缓冲液装入组化盒内，微波加热至沸腾状态，复水完成的切片放入沸腾的缓冲液中（放置过程速度要缓慢，防止因温度变化较大导致的组织片子脱落），将组化盒再次放入微波炉内，间断性微波加热修复，具体要求：保持修复液温度95度以上且不沸腾具体操作：1）组化盒放入微波炉内，关好炉门，静置90s，此间调整火力为80%，持续时间20min（能够保证循环时间够即可）2）静置完成，打开开始按钮，微波加热计时，以微波炉工作时间为准计时12~17s，暂停加热，静置计时90s，此间不打开微波炉门3）静置完成，重复步骤2加热过程4）重复2、3过程10-15次，修复完成14.修复完成后，将组化盒从微波炉内取出（防止烫手），室温放置，自然冷却至室温15.冷却完成后，将组化架从修复缓冲液中轻轻取出，置入另一装有PBS缓冲液的组化盒内摇床震荡清洗（摇床速度不能太快，以组化盒内液面震荡摆动为宜，太快易使片子脱落），清洗5minX316.（一）免疫荧光染色1）用组画笔沿组织片周边，划线圈住组织所在区域，划线距离组织5mm左右（太远会浪费抗体，太近易造成边缘效应）2）将切片置于孵育盒内（盒内加入适量水分保持湿度），5%BSA均匀滴加于组织切片上，分布于整个圈住区域，避光孵育1h3）孵育完成后，将切片重新置于切片架上，用PBS于组化盒内振洗5minX34）一抗稀释液或者PBS稀释一抗至工作浓度，将一抗滴加在切片上，用200ul枪头将抗体均匀涂布至整个圈住区域，将切片放置于孵育盒，盖好盖子置4度孵育过夜；5）孵育时间到后，将孵育盒拿出置室温复温30min，PBS振洗5minX36）PBS稀释荧光二抗至合适浓度（通常1:200），将二抗滴加在组织片上，放在孵育盒避光孵育1h，避光PBS振洗5minX37）用hoechst或DAPI染核（本实验室常用hoechst，1:1000稀释至工作浓度），hoechst避光染核15min，避光PBS振洗5minX38）甘油或是抗淬灭封片剂，避光封片；9）直接成像拍照，或放置在4度保存，最长不要超过3天（建议封片后及时进行成像处理，因为放置时间越长，荧光淬灭越严重）注意：整个染色过程中，组织切片均应保持湿润，否则会大大增加成像背景，降低图片质量。（二）免疫组织化学染色1）将切片放置在孵育盒内，3%H2O2均匀滴加于切片，避光孵育15min（去除内源性过氧化物酶，减少非特异性显色）2）孵育完成后，PBS振洗5minX33）用组画笔沿组织片周边，划线圈住组织所在区域，划线距离组织5mm左右（太远会浪费抗体，太近易造成边缘效应）4）将切片置于孵育盒内（盒内加入适量水分保持湿度），5%BSA均匀滴加于组织切片上，分布于整个圈住区域，避光孵育1h5）孵育完成后，将切片重新置于切片架上，用PBS于组化盒内振洗5minX36）一抗稀释液或者PBS稀释一抗至工作浓度，将一抗滴加在切片上，用200ul枪头将抗体均匀涂布至整个圈住区域，将切片放置于孵育盒，盖好盖子置4度孵育过夜；7）孵育时间到后，将孵育盒拿出置室温复温30min，PBS振洗5minX38）滴加相应抗性二抗（实验室使用的为中山金桥试剂盒），室温孵育1h9）配置合适体积的DAB显色液（中山金桥试剂盒），二抗孵育完成后，PBS润洗5minX3，将DAB显色液滴加在切片上，于显微镜下观察样本的显色情况，显色深度合适后，将切片置入备好的自来水中，终止显色过程，记录所需要显色时间，控制同一批样本的显色时间一致；10）显色完成后，将切片置于苏木素染液中染核（染色时间根据苏木素染液配制时间长短决定，新鲜配制的染液，染色1-2min即可，染液时间较长，则需要延长染色时间；染色液配制依次最长使用时限不超过6个月，一般在三个月时，染色效果便开始明显下降）11）染色完成后，将切片置入自来水中洗去多余染液，后将