基于核磁共振技术的代谢组学研究进展

基于核磁共振技术的代谢组学研究进展1.生命科学领域的核磁共振技术2.代谢组学概述3.基于核磁共振的代谢组学研究进展一、生命科学领域的核磁共振磁共振成像(NMRI,NuclearMagneticResonanceImaging)磁共振定域谱(MRS,MagneticResonanceSpectroscopy)核磁共振波谱(NMR,NuclearMagneticResonanceSpectroscopy)核磁共振二、代谢组学概述JeremyKNicholsonImperialCollegeLondon，UK代谢组学的定义Metabonomics:thequantitativemeasurementofthemulti-parametricmetabolicresponseoflivingsystemstopathophysiologicalstimuliorgeneticmodifications对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态多参数代谢应答的定量测定。J.K.Nicholson,J.C.Lindon,E.Holmes.Xenobiotica,1999,29:1181-89.技术：NMR动物代谢分析：动物的体液和组织OliverFiehnUniversityofCaliforniaHealthSciencesDriveDavis,USAMetabolomics:comprehensiveanalysisofallthemetabolitesofanorganism.Thequantitativemeasurementofalllowmolecularweightmetabolitesinanorganism’scellsataspecifictimeunderspecificenvironmentalconditions.生物体所有代谢物的系统分析。本质是“给定细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物的定量分析”。O.Fiehn.PlantMol.Biol.,2002,48:155–171.技术：GC-MS植物代谢分析：细胞代谢组学的发展198219831984198919992000200120022004Sadler,BuckinghamandNicholson:Firstpublicationon1H-NMRofbloodandplasmaNicholson,etal.:Multi-componentanalysisofspectradatafromraturineNicholsonandWilson:NMRspectroscopyofbiofluidsNicholson:DefinitionofMetabonomicsHaselden,etal.:FirstindependentPharmapublicationofMetabonomicsNicholson,Lindon,andHolmes:PublicationinNatureonMetabonomicsHolmesandAntti:ExplanationofstatisticsinMetabonomicsIncreasing#ofpublicationsVanDeGreef:publicationofMSforurineprofiling19701997Oliver:DefinitionofMetabolomeHorming,etal.:Metabolicprofilesofmetabolitesinhuman代谢组学的中心任务对生物体液和组织中内源性代谢物质进行系统测量和分析。对生物体在受到病理生理上的刺激以及某种基因修饰所带来的代谢物的动态变化进行量化和编录，从而得到生物体代谢随时间及生化过程的变化而改变的信息。将这些信息与病生理过程中的生物学事件关联起来，从而确定此变化规律相关的靶器官和作用部位，进而确定相关的生物标志物。系统生物学(SystemsBiology)的组成表现型(phenotype)个体(individual)器官(organ)组织(tissue)细胞(cell)代谢物(metabolite)蛋白质(protein)mRNADNA代谢组(metabonome/metabolome)蛋白质组(proteome)转录组(transcriptome)基因组(genome)代谢组学(metabonomics/metabolomics)蛋白质组学(proteomics)转录组学(transcriptomics)基因组学(genomics)系统生物学(SystemsBiology)不同组学关系及分析技术NMR,GC&MSGeneMetabolomicsisMoreTimeSensitiveThanOther“Omics”MetabolomicsProteomicsGenomicsResponseResponseResponseTimeGenomicsTranscriptomicsProteomicsMetabonomicsTargetmaterialGene,chromosome(geneticcode)mRNA(geneticcode)Protein(functionoftheprotein)LowmolecularweightmetabolitesMW100,000-120,000100,000-120,0005,000-20,000100-5000CharacteristicsContextindependentContextdependentContextdependentContextdependentAnalysisMapping,sequencingSequencingSeparation,characterizationSeparation,characterizationMethodsDNAsequencerHybridization2Dgel,MaldiTOFNMR,MS,GC,LCHuman30,000genome109?~2,500各种组学技术的比较代谢组学分析检测技术UPLC,HPLCCE/microfluidicsLC-MSFT-MSQqQ-MSNMRspectroscopyX-raycrystallographyGC-MSLIFdetection♥简便：样品不需复杂预处理，检测不需严格分析条件，避免引入干扰物的可能。♥快捷：常规1HNMR谱只需几分钟，且对低分子量和高分子量的代谢物均能给出定性和半定量的信息。♥避免漏检：不需预先选定化合物，在对待测物知识非常有限的情况下意义尤为重要。基于NMR的代谢组学的特点♥不破坏样品的原有组成：NMR方法具有无损伤性,可以在生理条件下对样品进行实时检测且不影响混合物的生理生化性质甚至化学平衡，以达到模拟体内条件和进行分子水平的分析需要。♥NMR方法可以进行实时和动态的检测。基于NMR的代谢组学的特点♥分析组织的高分辨魔角旋转(HR-MAS)NMR方法：消除了磁场不均匀性、化学位移各向异性和偶极－偶极相互作用带来的谱线增宽影响，从而可以获得与液体高分辨NMR相媲美的分辨率。♥无偏向性:NMR对所有化合物的灵敏度是一样的,氢谱中谱峰和化合物的氢原子是一一对应的,所测的每个氢原子都有其相关的谱峰,并且信号的强弱反映样品中各组分的相对含量。基于NMR的代谢组学的特点♥多参数：从核磁谱图中的多种参数得出结构信息。对于药物代谢来说，可以通过化学位移、谱峰的多重性、偶合常数、弛豫时间、NOE效应、谱峰强度等多种参数对同一问题做全面的反映。♥多核与多维NMR：解决同一问题可采用多核（1H、13C、15N、31P、23Na、7Li、139La等）和多维（2DCOSY、NOESY、TOCSY、HSQC）等多种核磁共振编辑手段和实验方法。基于NMR的代谢组学的特点♥检测灵敏度低：500MHz谱仪的1HNMR的检测限理论为10μM。♥水峰过强：体液中的生物分子一般其浓度为毫摩尔级，水中质子浓度约为100mol/L，是生物分子浓度的105倍!♥检测动态范围有限：很难同时检测同一样品中含量相差很大的物质。♥谱峰重叠及谱线较宽。NMR检测生物样品中存在的问题代谢组学中主流技术的比较ChromatographyMassSpectrometryNMRObjectiveYesYesYesReproducibilityPoorGoodGoodResolutionFairFairGoodSensitivitySelectiveSelectiveFairUnbiaseddetection(Simultaneous)NoNoYesHolisticNoNoYesMolecularinformationPoorFairRichSamplepreparationExtensiveExtensiveLittlePre-knowledgerequirementsYesYesNoinvivo/insituImpossibleAlmostimpossibleYesThroughputFairHighHighRecurrentexpenditureHighHighLowLabourintensivenessFairFairLowCostpersampleFair/lowFairLowAnalyticalApproachesBio-systemsExogenousEndogenous•Exposureassessment•Bio-monitoring•DiseasediagnosticsTimecourseDoseresponseToxins,DrugsEnvironmentaletcMetabolicpathwaysDatabasesMol.Biosyst.2009,5:288;J.Proteome.Res.2009,8:5657;2009,8:352.代谢组学方法和流程三、基于NMR的代谢组学研究进展在药物毒理代谢组学的研究领域，最为瞩目的工作是国际COMET(ConsortiumforMetabonomicToxicology)计划，旨在建立代谢组数据库，并为目标器官及其位点的毒性建立预测性专家系统。他们已经建立起了第一个基于机器学习的实验室啮齿动物肝脏和肾脏毒性预测的专家系统。1.毒理研究肾毒素：HgCl2、CdCl2、Na2CrO4、硝酸铀酰、苯酚、对氨基苯酚、六氯丁二烯(HCBD)、顺铂、2-溴乙胺(BEA)、丙烯亚胺(PI)等肝毒素：肼、异硫氢酸萘(ANIT)、半乳糖胺(GaIN)、羟丁基甲苯(BHT)例1.各种肾毒素对大鼠尿液1HNMR谱的影响。A,对照组；B，20mg/kgNa2CrO4(肾脏近曲小管毒)组；C，50mg/kg对氨基苯酚(肾脏近直小管毒)组；D，50mg/kg丙烯亚胺(令肾髓质坏死)组；E，250mg/kg2-溴乙胺(产生急性肾乳头坏死)组。-25-20-15-10-50510152025-30-20-10010PC1PC2PAPANITControl-15-10-5051015-40-30-20-10010PC1PC2ANITControla-naphthylisothiocyanite(ANIT)p-Aminophenol(PAP)Control尿中乳酸升高：急性肾小管受损TMAO、DMA、DMG和琥珀酸水平升高：肾乳头受损氨基酸，乳酸（血中）升高：急性肝受损氨基酸，乳酸（尿中）升高：肾小管损坏尿中琥珀酸升高，α-酮戊二酸升高，柠檬酸降低：肾小管酸中毒或线粒体酶活性降低牛磺酸升高：肝脏受损酮体含量升高：线粒体中酶代谢紊乱肌酸含量升高：睾丸毒一些重要的NMRmarkers基于NMR的代谢组学方法不仅能区分组织器官的正常与非正常的状态，而且能给出毒性作用的靶器官以及作用机制，识别出毒性的生物标记物。2.药物代谢及安全性评价药物种类：利尿剂（乙酰唑胺），抗菌素（氨比西林、苄基青霉素、先锋霉素、氟氯西林、青霉素），中枢神经药（脱氧麻黄碱），抗炎解热镇痛药（