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1《生物化学》实验指导书2017年03月28日修订目录实验一生物化学实验常用仪器设备及使用实验二甲醛滴定法实验三糖的定量：3，5－二硝基水杨酸比色法实验四粗脂肪提取和含量测定实验五血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳实验六动物组织中脱氧核糖核酸的制备及测定实验一生物化学实验常用仪器设备及使用一、生物化学实验须知1．实验室规则(1)实验课必须提前5分钟到实验室,不迟到,不早退，应自觉遵守课堂纪律。(2)使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约,应特别注意保持药品和试剂的纯净,严防混杂污染。(3)实验台、试剂药品架必须保持整洁,仪器药品摆放井然有序。实验完毕,需将药品、试剂排列整齐,仪器洗净倒置放好,实验台面抹拭干净,经教师验收仪器后,方可离开实验室。(4)使用和洗涤仪器时,应小心谨慎,防止损坏仪器。使用精密仪器时,应严格遵守操作规程,发现故障应立即报告教师,不要自己动手检修。(5)在实验过程中要听从教师的指导,严肃认真地按操作规程进行实验,并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。课后写出实验报告,由课代表收齐交给教师。(6)仪器损坏时,应如实向教师报告,真填写损坏仪器登记表,然后补偿一定金额。(7)每次实验课安排同学轮流值日,值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。2．实验记录实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写在记录本上。实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验中观察到的现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。原始记录必须准确、简练、清楚。3．实验报告的书写实验结束后,应及时整理和总结实验结果,写出实验报告。（1）标题标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验组号、实验者及同组者姓名、实验室条件。（2）实验目的（3）实验原理2应简述基本原理，不要完全照抄实验指导书。（4）操作步骤操作步骤(或方法)可以采用流程图的方式或自行设计的表格来表达。（5）实验结果将实验中的现象、数据进行整理、分析，得出相应的结论。建议尽量使用图表法来表示实验结果，这样可以使实验结果清楚明了。（6）讨论包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的改进意见等。4．生物化学实验课评分标准�实验预习情况（10%）�实验操作情况（20%）�实验报告情况（30%）�实验考试成绩（40%）二、生物化学实验仪器简介及实验室参观仪器设备名称型号、规格国别、厂家出厂日期冷冻离心机3K30德国SIGMA公司2004-11-01基因扩增仪PCT-220美国MJ公司2004-11-01荧光扫描仪PerSonal4100A美国Axon公司2004-11-01凝胶成像仪B10-BADCELOOCEQ*无2005-05-01石英晶体分析仪QCM922美国A.M.T公司2004-07-01纳米粒度及Zeta电位分析仪ZEN3601英国公司2005-11-01接触角测定仪OCA20法国DIG公司2005-11-01生物安全柜LB2-4A1新加坡公司2005-11-01喷射式生物芯片制备仪NanoPlotter.NP1.2法国Gesim公司2005-11-01DNA合成仪ASM-800俄罗斯Biosset公司2005-11-01荧光倒置显微镜TE2000-U日本尼康公司《中国》2005-11-01全自动比表面孔径测量分析仪NOVA2000e美国康塔公司2005-11-01X射线衍射仪D8Advance法国布鲁克公司2005-11-01光度计TD20/20n美国普洛麦格公司2005-11-01超临界流体萃取设备HA221-50-06海安华安石油科研仪器有限公司2006-10-01电化学工作站CHI660B*上海辰华仪器公司2005-03-01无氧无水手套箱Universal1220/1000/900上海米开罗那机电公司2005-11-01生物发哮智能控制系统GBIL-10LC*镇江东方生物工程技术公司2005-11-01双光束紫外可见分光光度计TU-1901*北京普析通用仪器公司2005-03-01扫描电子显微镜S-3000NSEM日本日立公司2006-12-11自动核酸蛋白测定仪U-0080D*日本日立公司2008-05-28实时定量PCR仪Option2BIO-RAD美国ABI公司2010-06-28梯度PCR扩增仪Veriti美国ABI公司2014-06-06傅立叶变换红外光谱仪Frontier美国PE公司2014-06-063荧光基因检测仪Nano瑞士Roche公司2014-06-06基因扩增仪9700美国ABI公司2014-06-06二氧化碳培养箱Galaxy170S英国NBS公司2014-06-06超纯水机PURELAB-flex英国ELGA公司2014-06-06超低温冰箱DW-86L490青岛海尔特种电器公司2014-12-23振动样品磁强计HH-15南京南大仪器厂2014-10-30全自动多功能酶标仪MK3美国热电公司2015-04-28电化学工作站CHI660E上海辰华2015-06-08发酵设备6010T上海汇和堂2015-06-10微电泳分析系统Qsep100台湾Bioptic公司2015-06-30梯度PCRMCnexus德国EPPendorf公司2015-06-30荧光定量PCRLightcycler96瑞士Roche公司2015-06-30低温热性能测试系统DSCQ20-TGAQ50美国TA公司2015-06-30凝胶成相系统FX5法国vilber公司2015-06-30快速核酸/蛋白分析仪D30德国EPPendorf公司2015-06-30高速离心机5424德国EPPendorf公司2015-06-30生物化学实验课所用仪器高速组织匀浆机FSH-2索氏提取器SXT-6分光光度计T6全温培养摇床HNY-200D干热灭菌器GR-30冰箱KK25V61TI台式离心机5417C循环水泵SHZ-3A电子天平AUY220DNA扩增仪S630紫外可见分光光度计T6新世纪琼脂糖水平电泳槽DYCP-31D双稳定时电泳仪DYY-6C4实验二甲醛滴定法一.目的了解并掌握甲醛滴定法的原理和方法。二.原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：水溶液中的氨基酸为两性离子，不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨基结合，形成—NH—CH2OH，—N(CH2—OH)2等羟甲基衍生物，NH3+上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定NH3+放出的H+，测出氨基酸，从而计算氨基酸的含量。如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品为多种氨基酸的混合物（如蛋白质水解液），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。此外，脯氨酸与甲醛作用后，生产不稳定化合物，致使滴定结果偏低；酪氨酸的酚基结构，又可使滴定结果偏高。甲醛滴定发常用以测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加，滴定值也增加，滴定值不再增加、保持恒定时，表明水解作用已完全。三.仪器、试剂、材料1.仪器100ml锥形瓶（×3）；碱式滴定管25ml（×1）；吸管2.0ml（×2）、5.0ml（×2）、10ml（×1）。2.试剂(1)0.5%酚酞乙醇溶液：称0.5g酚酞溶于100ml60%乙醇。(2)0.05%溴麝香草酚蓝溶液：0.05g溴麝香草酚蓝溶于100ml20%乙醇溶液。(3)1%甘氨酸溶液：1g甘氨酸溶于100ml蒸馏水。(4)标准0.100mol/L氢氧化钠溶液：可用0.100mol/L标准盐酸溶液标定。(5)中性甲醛溶液：甲醛溶液500ml，加0.5%酚酞指示剂约3ml，滴加0.1mol/LNaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。四.操作方法5将3只100ml锥形瓶标以1、2、3号。于1、2号瓶内各加甘氨酸（或样品）2.0ml及蒸馏水5ml；于3号瓶内加蒸馏水7.0ml。向3只锥形瓶中各加中性甲醛溶液5.0ml，0.05%溴麝香草酚蓝溶液2滴及0.5%酚酞乙醇溶液4滴。然后用标准0.100mol/L氢氧化钠溶液滴定至紫色（pH8.7~9.0）。溶液颜色由黄→绿→紫，紫色为滴定终点。五.结果处理m=（V1－V0）×1.40082式中m：1ml氨基酸溶液中含氨基酸氮的质量（mg）；V1：滴定样品消耗NaOH溶液的体积（ml）；V2：滴定空白消耗NaOH溶液的体积（ml）；1.4008：每毫升0.1mol/L氢氧化钠溶液相当的氮质量（mg/ml）六.注意事项1.临近终点时应仔细滴定，切忌滴过量。2.甲醛有毒，若不慎接触皮肤，应立即用水冲洗。实验过程应保持良好的通风。3.标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。4.中性甲醛溶液在临用前配制，若已放置一段时间，则使用前需要重新中和。5.本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作要按分析化学要求进行。6.脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。而酪氨酸的滴定毫升数结果偏高。七.思考题1．甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么？2．为什么NaOH溶液滴定氨基酸—NH3+上的H+，不能用一般的酸碱指示剂？3．测氨基酸的含量时，甲醛溶液为何事先要加入酚酞并用NaOH滴定至微粉红色？6实验三糖的定量：3，5－二硝基水杨酸比色法一、实验类型验证性实验二、实验目的1、了解多糖的水解2、掌握3，5－二硝基水杨酸法测定糖含量的原理与方法3、掌握721紫外可见分光光度计的用法三、预习要求预习书中糖类化学及其分光光度计的使用。四、实验原理还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。单糖都是还原糖，均可以利用其还原性进行定量。双糖和多糖等则不一定就是还原糖，如蔗糖是非还原性的、淀粉的还原性很小。利用糖的溶解度不同，可以把还原糖和非还原糖分离开，然后利用多糖的酸水解，使之转化为有还原性的单糖，从而可以使多糖也可以利用还原性进行定量。借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量。当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1-18018=0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。COOHOHNO2O2N还原糖（碱）加热COOHOHO2NNH23,5-二硝基水杨酸（黄色）3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）CCHOOHOHCHCH2OHOH()n()nCHCOHOHCHCH2OHOH（碱）烯二醇糖酸7计算公式如下：100样品重量样品稀释倍数还原糖毫克数还原糖％＝9.0100样品重量样品稀释倍数水解后还原糖毫克数总糖％＝五、实验材料及设备1、材料：面粉2、仪器：分光光度计(72型)，玻璃比色皿（1cm），电子天平（0.01mg），恒温水浴箱3、器皿：刻度试管（25mL以上），容量瓶（100mL），移液管（1mL、2mL、10mL），量筒（50mL），锥形瓶（100mL），烧杯（250mL、50mL），滴管，玻璃漏斗，洗耳球，滤纸（11cm），pH试纸（6~9），坐标纸，洗瓶（500mL），白瓷反应板，试管架，移液管架，试管夹，玻棒4、溶液或试剂（1）葡萄糖标准液（1mg/mL）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。（2）3,5-二硝