对β-胡萝卜素测定方法的认识

对Β-胡萝卜素测定方法的认识姓名：邹俊楠班级：应用化学122班学院：化学工程学院学校：新疆农业大学对β-胡萝卜素测定方法的认识摘要：食品中的β-胡萝卜素可以用纸上层析法、薄层色谱法、分光光度法及高效液相色谱法等方法测定。本文简述了这些方法的原理条件及优缺点，并谈了谈自己的认识。Β-胡萝卜素作为维生素A的前体，是人体重要营养素，也能够影响蛋白质的合成和利用，促进体内软组织的生长发育。同时，β-胡萝卜素还有一定的防癌作用。因此，对β-胡萝卜素的研究倍受广注。β-胡萝卜素分子中存在多个共轭双键结构，对许多物理、化学、生物等因素都不稳定，例如光辐射、高温、酸、碱、游离卤素、水分等，但氧是影响胡萝卜素稳定的主要因素。它不溶于水、丙二醇、甘油、酸和碱，溶于二硫化碳、苯、氯仿、己烷及植物油等，几乎不溶于甲醇和乙醇。1测定方法1·1天然β-胡萝卜素的提取取切碎混匀的菜样30g，加入适量水(一般约l：0.5—2)，于捣碎机中捣碎，使匀浆呈稠糊状。因β-胡萝卜素对弱碱比较稳定，所以选用氨水：乙醇（5:35）作为稳定剂。稳定剂可以加快沉淀且使沉淀完全，从而减少β-胡萝卜素损失，提高提取率。加入2%的CaCl2·2H2O其沉淀量最大，且β-胡萝卜素的含量最高。因β-胡萝卜素是脂溶性物质，可以溶解在有机试剂中，根据相似相溶规律和β-胡萝卜素的理化性质，我们选用亲脂性较强的有机溶剂。为避免β-胡萝卜素的不必要损失，在除去溶剂时应避免高温，故应优先选择低沸点的溶剂。同时，根据β-胡萝卜素在不同溶剂中的溶解度；可以得出石油醚可以作为很好的β-胡萝卜素的溶剂。因为蔬菜糊中含有大量的水分，直接选用石油醚很难从其中萃取β-胡萝卜素，选用水溶性的丙酮和石油醚的混合液萃取，这样丙酮会有效地使渣干燥因而在随后的萃取中，色素可以高效地进入萃取液，提高了萃取率。故在萃取过程中，为了提高萃取率，应加入氨水：乙醇（5:35）作为稳定剂，2%的CaCl2·2H2O作为沉淀剂；用石油醚和丙酮混合物作为提取剂。1·2测定1·2·1纸层析法食品中的胡萝卜素可用生物学鉴定、溶剂分配和层析技术测定。50年代色层分析测定胡萝卜素已为世界广泛采用，中国医学科学院当时亦采用柱层析法。直至1975年，AOAC仍为柱层析法，但已不断改进。1952年Bauer曾提出类胡萝卜素的纸上层析法。1·2·1·1点样准确吸取待检液0.1—0.2ml(随胡萝卜素含量而定)在滤纸下端基线上AB两点间和CD两点间迅速来回进行带状点样(见图1)，一次点完。若按常规点状点样，需时约20分钟，且展开慢。故用改进的带状点样，只需10秒钟左右就能点完，展开速度比常规点样快，而且分离效果好。1·2·1·2展开将滤纸卷成圆筒状，固定两边后放入事先用石油醚饱和的层析缸内，进行上行展开(见图2)。(注意:纸纹方向与展开方向一致；缸内石油醚深度约1cm即可。)1·2·1·3洗脱取出滤纸自然挥发石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，放入盛有5ml石油醚的具塞试管中，用力振荡，使胡萝卜素完全溶于溶剂中。1·2·2薄层色谱法薄层色谱法是在一定尺寸的表面平整的玻璃、铝板或塑料板上，把硅胶、纤维素、氧化铝、聚酰胺或化学键合硅胶等吸附剂铺成薄层(通常厚度为0.10～0.25mm)作为固定相，用展开剂(流动相)把被测样品展开，从而进行色谱分离和分析的方法。1·2·2·1制板取30g硅胶G和70g的1%KOH溶液铺制2*5cm，0.25cm厚的薄板，风干后在105℃下活化1h。1·2·2·2点样及展开用微量定量点样管将β-胡萝卜素的样品溶液点于上述的薄层硅胶板上。将点样后的薄层板置于石油醚-丙酮混合液(100：5)饱和的层析缸内，于暗处展开，展开时间为50min，因为β-胡萝卜素极易被氧化，展开时间超过一小时后，β-胡萝卜素会迅速变化。后观察黄色斑点位置并计算各斑点的Rf值。1·2·3分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。1·2·3·1测定波长的选择精密称取干燥至恒重的β-胡萝卜素对照品适量，用少量氯仿溶解后，再用环己烷配置成2.5μg/ml的溶液，在400~500nm波长之间扫描可见光吸收光谱，可得到最大吸收波长为455±1nm。因此选择测定波长为455nm。β-胡萝卜素溶于氯仿，β-胡萝卜素对照品也极易溶于氯仿，所以选择氯仿为溶剂。1·2·3·2绘制标准曲线精密称取干燥至恒重的β-胡萝卜素对照品约20mg，置100ml量瓶中，加少量氯仿溶解，用环己烷定容。精密量取10ml置100ml棕色量瓶中，用环己烷定容，再精密量取4.0,5.0,6.0,7.0和8.0ml分别置50ml棕色量瓶中，用环己烷定容，以环己烷为空白，在455nm波长处测定吸收值。过程中使用棕色的量瓶，因为β－胡萝卜素遇光、空气不稳定，水溶液更不稳定，所以整个实验中应避光操作，故配置在棕色的量瓶中。1·2·3·3样品的测定取出适量的样品中的β-胡萝卜素，溶于氯仿中，并过滤，如此反复2~3次，后加入环己烷定容，在测定其吸光度，根据得到的吸光度值一定的计算得到样品中的β-胡萝卜素的含量。1·2·4高效液相色谱法高效液相色谱又称为高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱，是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断地改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。1·2·4·1高效液相色谱法的分析原理高效液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离。被测样品溶液经皂化后，β-胡萝卜素从样品中以游离态形式存在，用乙醇+环己烷萃取后洗涤、稀释、定容、过滤，用高效液相色谱法分离，紫外检测器，外标法定量。1·2·4·2流动相的选择以甲醇-四氢呋喃-BHT（9:1:0.01）为流动性，因为当甲醇与四氢呋喃的体积比例为9:1时，蔬菜中的β-胡萝卜素可以达到完全分离且分析时间相对较短，BHT是一种能够抑制或者延缓高聚物和其他有机化合物在空气中热氧化的抗氧化剂。1·2·4·3柱温的选择柱温能够影响分离效能和分析速度，所以柱温的选择十分重要。在β-胡萝卜素的分离和分析中，如果柱温大于25℃，分离度会逐渐降低，如果柱温小于20℃，峰形会变宽，柱效也会下降，且分析时间会延长，因此选择20℃最佳。1·2·4·4测定波长的选择检测器是紫外检测器，检测波长对β-胡萝卜素的响应影响很大。由全波长紫外扫描可知，β-胡萝卜素的最大吸收峰在448nm,故检测波长选择为448nm。1·2·4·5绘制标准曲线分别取β-胡萝卜素标准应用液2、5、10、20μl进样,色谱柱分离、紫外-可见光检测器检测。以保留时间定性,峰面积标准曲线法定量。1·2·4·6样品的测定在标准曲线测定的相同色谱条件下,根据样液中β-胡萝卜素含量进样5～20μl。2测定方法的比较因β-胡萝卜素对光、热、氧不稳定。且对β-胡萝卜素进行检测，一般要经过皂化、溶剂萃取、分离、浓缩、测定等多次操作，而每次操作都会对β-胡萝卜素造成部分损失。因此，探索一种快速、简便的测定β-胡萝卜素的方法尤显重要。2·1各方法适用范围的比较纸层析法和薄层色谱法在单独使用时，只能根据比移值对β-胡萝卜素进行定性测定，不能进行定量测定。分光光度法和高效液相色谱法，既能对β-胡萝卜素进行定性测定，又可以进行定量测定。但是分光光度法在测定样品之前没有对样品进行分离和提纯，无法避免其经常与叶黄素、叶绿素等也能被有机溶剂提取的色素的干扰。当测定较复杂的样品时，得到的结果就不具有说服力。因此分光光度法在单独使用时，适合于测定简单的样品。2·2各方法优缺点的比较纸层析法操作简单，所需实验仪器简便，对实验环境的要求不高，在一般实验室就可以进行，并且还有分离的时间短，分离效果较好的优点。但是测定范围有限，只能测定常量物质，不能测定微量物质，且只能对物质进定性的分析，不可以进行定量的分析。薄层色谱法操作较纸层析法而言相对较复杂，且实验时间长，不仅制板活化的时间长，而且分离的时间较纸层析法也较长。并且如若层析板制作较厚，展开剂展开较慢，β-胡萝卜素分离困难，所以在操作过程中，经验是十分重要的一项操作人员具备的素质。但是其测定的物质因提前进行了分离和提纯，进行定性测定时，较分光光度法的结果更加具有说服力，可是不能像分光光度法那样对物质进行定量的测定。分光光度法在测定之前没有对物质进行进一步的分离提纯，在测定较复杂样品时所得的结果不具有说服力，但是其操作相对简单，且所需实验仪器较高效液相色谱法所需仪器简便、便宜。高效液相色谱法前处理简便、快捷、准确度和灵敏度都可以达到分析要求，适合于微量测定，其分离速度也较快，分离时的温度也极易进行调节。它还可以同时测定β-，α-，γ-胡萝卜素及其他类胡萝卜素。考虑到β-胡萝卜素的不稳定性，高效液相色谱法是分离及测定β-胡萝卜素最好最快捷的方法。但是该方法需要特定的仪器，且仪器的价格昂贵，一般实验室很难达到要求。3个人认识分光光度法可以进行定性和定量测定，但是由于其在的定之前没有对物质进行进一步的分离提纯，导致在测定较复杂样品时的得到的结果不具说服力。同时纸层析法和薄层色谱法都是可以对物质进行分离和提纯的，所以可以将纸层析法和薄层色谱法与分光光度法一同进行使用。这样就可以解决其结果不具说服力的缺点。并且这样的方法和高效液相色谱法对实验室的要求相比其要求较低。这样联用的方法操作简便、易于掌握，也可以同时测定多种样品，测定结果具有较高的精确度和精密度。成本较低，不需要特定的仪器，适合于条件简陋的普通实验室。在两种方法联用时，我更加倾向于纸层析法与分光光度法联用。因为纸层析法的分离效果较薄层色谱法更好。