环境样品前处理-第6章衍生化

环境样品前处理第6章衍生化技术6.1衍生化目的与条件过程：化学反应→定量转化→适于分析。定义：借助化学反应将待测组份接上某种特定基团，从而改善其检测灵敏度和分离效果的方法。作用：把难于分析的物质转化为易于分析的物质，通过对反应产物的检测间接分析目标化合物。6.1衍生化目的与条件1.柱前衍生化：衍生化反应→定量生成→色谱分析。2.柱后衍生化：色谱柱分离→衍生化反应→检测。•分类：柱前衍生化和柱后衍生化。•流程：•机理柱前衍生化柱后衍生化分离-衍生产物检测-衍生产物检测-衍生产物分离-待测物本体衍生化6.1.1衍生化的目的•提高目标物可检测性：1.LC:提高检测灵敏度与选择性2.GC:改善色谱分离，通过增强目标物挥发性或者改善目标物极性3.提高理化稳定性4.为结构鉴定提供依据6.1.2衍生化的条件1.柱前衍生化反应需满足的条件：①反应迅速、定量、重复、条件不苛刻、易操作；②选择性高、具有专一性；③反应产物只有一种，无干扰；④衍生化试剂易得、通用性好。6.1.2衍生化的条件2.柱后衍生化反应需满足的条件：①反应迅速、定量、重复；②反应条件与色谱条件适应；③反应产物可检测；6.2.1气相色谱柱前衍生化（1）硅烷化衍生化方法（2）酯化衍生化方法（3）卤化衍生化方法（4）酰化衍生化方法方法6.2衍生化方法1.硅烷化衍生化方法本节首页退出本章质子性化合物如醇、酚、酸、胺等与硅烷化试剂反应，形成挥发性的硅烷衍生物R3Si—X+H—R`R3Si—R`+H—X•P135表6-12.酯化衍生化方法大多数有机酸挥发性、热稳定性差。在GC分析之前衍生为相应的酯。①甲醇法②重氮甲烷法③三氟乙酸酐法酯化反应①甲醇法本节首页退出本章甲醇法：有机酸与甲醇在催化剂的存在下加热，可以发生酯化反应，生成有机酸甲酯RCOOH+CH3OH催化剂RCOOCH3+H2O△硫酸、盐酸-加热三氟化硼BF3-室温催化剂②重氮甲烷法本节首页退出本章•非水介质中CH2N2与有机酸反应，生成有机酸甲酯RCOOH+CH2N2RCOOCH3+N2•重氮甲烷不稳定，有爆炸性，有毒！！③三氟乙酸酐法本节首页退出本章•醇或酚与有机酸反应，生成酯：RCOOH+R'OHRCOOR'+H2O•适合空间位阻较大的化合物。三氟乙酸酐3.酰化衍生化方法本节首页退出本章•在-OH、-SH、-NH等含有活泼氢的化合物上引入酰基→转化为弱极性的酯、硫酯或酰胺→改善挥发性和稳定性，含有卤离子的羰基基团可增强ECD响应。•优点：1.保护不稳定基团；2.提高糖类，氨基酸等物质的挥发性和热稳性；3.有助于混合物分离；4.使用ECD检测，分析物检测下限可降低很多。3.酰化衍生化方法本节首页退出本章（1）乙酰化法：提高挥发性•试剂：乙酸酐（AA）•样品：糖类•介质：多为非水•催化剂：吡啶等碱性化合物3.酰化衍生化方法本节首页退出本章（2）多氟酰化法：引入卤素！•试剂：三氟乙酸酐（TFA）、五氟丙酸酐（PFP）、七氟丁酸酐（HFB）、N-甲基双（三氟乙酸酐）咪唑（MBTFA）、1-(三氟乙酰)咪唑（TFAI）•样品：药物等大分子•介质：非水4.卤化衍生化方法本节首页退出本章•引入卤素→ECD检测器→改善挥发性和稳定性。（1）卤素法：加成或取代4.卤化衍生化方法本节首页退出本章（2）卤化氢法：加成或置换（3）NBS法：烯丙位取代•P137HPLC化学衍生化分类在线化学衍生化★是否与HPLC系统联机离线化学衍生化柱前衍生化★发生衍生化发应的先后柱后衍生化本节首页退出本章6.2.2液相色谱柱前衍生化1.紫外衍生化反应2．荧光衍生化反应3．电化学衍生化反应优点：（1）对用作流动相的溶剂体系没有限制；（2）反应条件，反应速率不受限制；（3）通过选择合适的试剂以及萃取方法，可以消除许多干扰；（4）过量溶剂、试剂容易除去；（5）转变成合适的衍生物，可使分离度改进。缺点:（1）操作过程繁琐，容易影响定量准确性。（2）当一个复杂组分样品经过衍生化反应后，有可能产生多种衍生化产物给色谱分离带来困难。本节首页退出本章（1）紫外衍生化反应•液相色谱法中，紫外吸收检测器是最常见的一种高灵敏度检测器•很多化合物在紫外可见光谱区无吸收•与带有紫外吸收基团的衍生试剂在一定条件下发生反应，反应产物带有发色基团而能被紫外吸收检测器检测。本节首页退出本章（1）紫外衍生化反应苯甲酰氯+胺、醇、酚→苯甲酸酯类衍生物（２００～３６０ｎｍ）（1）苯甲酰化反应本节首页退出本章（1）紫外衍生化反应（2）苯甲磺酰化反应（3）DNFB与醇、胺、氨基酸反应（4）PITC与氨基酸反应（5）有机酸酯化反应（6）羰基与DNPA或PNBA反应P139-140:更多反应：P137-138表6-2（2）荧光衍生化反应•定义：用含有芳香环或杂环的大基团取代被测化合物分子中的一个或几个原子，以此将荧光物标记入分子，此时被测分子的结构基本不变•特点：高选择性、高灵敏度•荧光检测器灵敏度比紫外检测器的灵敏度高10到1000倍（2）荧光衍生化反应例：福多司坦血药浓度测定方法的建立2、半胱氨酸结构式：1、福多司坦结构式:结构特点HOCH2CH2CH2SCH2CHCOOHNH2HSCH2CHCOOHNH23、结构特点：•为半胱氨酸衍生物；•没有强的紫外吸收，•没有荧光；•分子量小，极性大。羧基伯氨基衍生化产物的激发波长为338nm，发射波长为450nmHHOOHOCH2CH2CH2SCH2CHCOOHNH2OHCH2CH2SHNSCH2CH2OHCHCOOHCH2SCH2CH2CH2OHPH+10.4反应过程：参考氨基酸的测定方法，选择合适的衍生化试剂衍生化后测定：荧光衍生试剂•常用的荧光衍生化试剂（亦称荧光探针）有：荧光衍生试剂的基本构成取代基荧光团（试剂分子母体）反应基团胆磺酰肼DNS-H荧光衍生化试剂亦称荧光探针P140表6-3常用的荧光衍生试剂1.丹磺酰氯（1-二甲氨基萘-5-磺酰氯）2.丹酰肼（1-二甲氨基萘-5-磺酰肼）荧光衍生化试剂的分类：（一）胺的衍生试剂（二）醇、酚的衍生试剂（三）羰基化合物的衍生试剂（四）羧酸类化合物的衍生试剂邻苯二甲醛OPA4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑NBD-Cl荧光素异硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯AQC（一）胺的衍生试剂：（二）醇、酚的衍生试剂:羰基氯类：FMOC,CEOC磺酰氯类:DNs-Cl卤代三嗪类:EDTN1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）（三）羰基化合物的衍生试剂:肼类DNs-HCEOC-H氨基类氨基甲基芘（四）羧酸类化合物的衍生试剂:溴甲基类BrMMC哌嗪基类DBD-Pz7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)（四）羧酸类化合物的衍生试剂:重氮甲烷基类ADAM其它类9-(2-羟乙基)-吖啶酮HEA4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素(ADMC)9-蒽重氮甲烷（3）电化学衍生化反应•样品与某些试剂反应，生成具有电化学活性的衍生物，以便在电化学检测器上有较高的响应。•环境介质对电化学反应有很大影响，如离子强度、pH值和溶剂组成等。常用的电化学衍生化试剂：（1）带硝基的芳香化合物：P141表6-4（2）芳氨基、酚羟基等•上述试剂与羟基、氨基、羧基、羰基化合物反应生成具有电化学活性的衍生物。6.2.3柱后衍生过程•将样品先注入色谱柱，按选定的色谱条件使样品组分得以分离；•当各个组分从色谱柱流出后，分别与衍生化试剂相遇，在一定的反应条件下，生成具有某种检测特性的衍生化产物•进入检测器测定。•要求：（1）对流动相的选择更严格，必须考虑衍生化试剂、反应产物的溶解度，以及它们与流动相可能发生的副反应；（2）在高效液相色谱中采用高流速，因此反应速率必须很快（小于30s）；（3）检测器对衍生化试剂不能有响应。•柱后衍生流程图泵进样阀色谱柱衍生化试剂泵衍生化反应器检测器记录仪•柱后反应器1.毛细管式2.空气分割式3.填充柱式P143图6-26.2.4固相化学衍生化法（1）还原型固相反应剂1.固相化学反应剂6.2.4固相化学衍生化法•酶是一种具有特殊三度空间构象的蛋白质，能够催化某一底物进行特异性化学反应，生成特定的反应产物。•酶的催化反应具有高度的专一性•酶试剂通常在反应中是不消失的，可重复使用•酶的固定化可分为化学和物理两种方法，化学法是指在酶和载体之间生成共价键，并保留其生物活性，而物理方法仅是吸附在固体表面。2.固定化酶2.固定化酶•对载体的要求：对酶应有较高的亲和力和较大的容量、易再生。一般大孔径、大表面积的载体容量大，而容量越大，固定化酶的活性越高，寿命越长。•硅球、玻璃微球、氧化铝、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和纤维素等都可以作为载体。如纤维素或葡聚糖凝胶与溴化氰反应，然后用酶处理：2.固定化酶•酶一旦被固定，其稳定性增加。•利用酶反应的专一性完成的衍生化反应，可以改变底物的化学特性，提高色谱分析的灵敏度和选择性。P144图6-3本节首页退出本章•制备衍生物的反应罐瓶•其它衍生化方法：手性衍生化用手性试剂与外消旋体反应，在分子内导入另一手性中心，柱前衍生反应生成一对非对映异构体，两者间无镜相关系，物理化学性质不同，可用常规的色谱分离条件进行分离。•手性衍生化分离通常基于以下原因：⑴不宜直接拆分，如游离胺类在手性固定相上往往呈颇弱的色谱性质，生成中性化合物则获得显著改善．⑵添加某些基团，以增加色谱系统的对映异构选择性．⑶提高紫外或荧光检测的效果．6.3衍生化技术在环境分析中的应用•P144作业1.画出柱后衍生流程示意图。2.用表格形式总结气相色谱柱前衍生化的方法原理和化学反应式实验课•时间：5.22，5.29，6.5下午2：20•集合地点：西门-互助巷口•学习地点：礼让街23号•单位：青海出入境检验检疫局，五楼