第八章-蛋白质和氨基酸的测定

第八章蛋白质及氨基酸的测定第一节概述1.蛋白质的元素组成（Theelementsofprotein）•C：50-55%N：15-18%O：20-23%•H：6-8%S：0-4%•微量元素：P、Fe、Zn、Cu2、基本结构单位：氨基酸3、蛋白质的变性作用。4、蛋白质分析的重要性•生物活性测定•功能性质调查•营养标签总蛋白质含量氨基酸组成蛋白质的营养价值5、蛋白质的测定方法利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法凯氏定氮法杜马斯法福林酚法染色法第二节蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了5种染料。二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（3种方法）（二）脂蛋白的显色（2种方法）蛋白质的测定方法•1凯氏定氮法（1833年Kieldahl,常量法、微量法、自动定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法）•2双缩脲法•3福林酚（Lowry）法•4BicinchoninicAcid法•5280nm紫外吸收法•6染色法•6.1阴离子染色法•6.2布兰德福特（Bradford）法•7茚三酮法•8比浊法•9杜马斯法（燃烧法）•10红外光谱法一、凯氏定氮法（常量）凯氏定氮法通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白含量。此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。原理•样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催化剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白质分解，其中C,H氧化为CO2和H2O，有机N转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。加碱蒸馏时氨蒸出，用硼酸吸收后，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。•样品制备•消化•中和、蒸馏•滴定•计算利用换算系数可以把氮的百分含量转化成样品粗蛋白质含量。由于大部分蛋白质含有16%的氮，所以其换算系数一般为6.25（100/16=6.25）。即：%N×6.25=%蛋白质蛋白质含量换算系数蛋或肉16.06.25牛奶15.76.38小麦18.765.33玉米17.705.56燕麦18.665.36大豆18.125.52大米19.345.17部分食品的蛋白质换算系数*在消化反应中,为了加速蛋白质的分解,缩短消化时间,常加入下列物质1）硫酸钾:提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在340℃左右,而添加硫酸钾后,可使温度提高至400℃以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解,水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大,故沸点升高,其反应式如下：K2SO4+H2SO4→2KHSO42KHSO4→K2SO4+H2O↑+SO2•硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起引起生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。•除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。（2）（催化剂、指示剂）硫酸铜起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。指示蒸馏时的碱加入量是否足够。除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二氧化钛等也可用的催化剂。装置操作步骤消化准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g，液体样品10～20ml）→移入凯氏烧瓶→加入研细的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml→摇匀→安装消化装置→于凯氏瓶口放一漏斗→以45°角斜支于有小孔的石棉网上→用电炉先以小火加热至内容物全部炭化，泡沫停止后→加大火力保持瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明→继续加热微沸30分钟→冷却→定容。加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。蒸馏吸取5mL稀释后的消化液→加入凯氏定氮仪内→加10mL40%的氢氧化钠→夹好漏斗夹→冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶内预先装入10ml4%硼酸溶液及混合指示剂)→加热蒸馏至氨全部蒸出(由红变蓝后约10分钟)→将冷凝管下端提离液面→用蒸馏水冲洗管口→继续蒸馏1分钟→加热。滴定将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶液直接滴定至由蓝色变为微红色（用甲基红－溴甲酚绿混合指示剂）即为终点，同时作一试剂空白。计算•Page158公式•当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3ml后再继续消化。•一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。•蒸馏装置不能漏气。•蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。•硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。•蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。二、自动凯氏定氮法将凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的一套装置，原理与试剂同前。自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置。消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外线加热装置组合而成的消化炉。方法特点及应用范围•灵敏•准确•快速•样品用量少三、微量凯氏定氮法•原理及适用范围同常量凯氏定氮法•主要仪器：凯氏烧瓶（100mL）；微量凯氏定氮仪•试剂：0.01000mol/LHCl标准液，其余同常量法•Page160蛋白质的快速测定－双缩脲法•原理方法特点及应用范围•灵敏度较低，但操作简单快速，在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。•适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品的测定。也可定量测定分离纯化后的蛋白质。步骤•标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50ml纳氏比色管中，然后各加入1ml四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液（①或②）准确稀释至50ml，振摇10分钟，静置1小时，取上层清夜离心5分钟，取离心分离后的透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋白质的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。•样品的测定：准确称取用品适量（使得蛋白质含量在40～110mg之间）于50mL纳氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质mg数，进而由此求得蛋白质含量。优点：•该方法比凯氏定氮法费用低，速度快（可在不到30min的时间内完成），是分析蛋白质最简单的方法。•比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色偏离。•几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应。•不包含非多肽或非蛋白质来源的氮。缺点：•不如福林酚法灵敏，分析时至少需要2~4mg蛋白质。•如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加。•高浓度的胺盐会干扰反应。•不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同，例如明胶的双缩脲反应产生红紫色。•如果有高浓度的脂（用醚抽出）或碳水化合物存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色。•此方法不是一个测量绝对值的方法，必须用已知浓度的蛋白质（如BSA）或经凯氏定氮法校正。三、福林酚（Lowry）法原理•蛋白质与福林酚试剂反应，生成的蓝色复合物。其中蛋白质中的肽键与碱性铜离子反应形成双缩脲反应，同时蛋白质中存在的酪氨酸和色氨酸同磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生颜色，蛋白质浓度与吸光度有较好的线性关系。优点•因为福林酚法简单、灵敏，已被广泛应用于蛋白质的生物化学中。然而，一般不用于测定未从食品混合物中纯化的蛋白质。1．非常灵敏：A:较双缩脲法灵敏50~100倍。B：较280nm紫外吸收法灵敏10~20倍。C：较茚三酮法灵敏好几倍。D：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。2．测定结果较少受到样品混浊度的影响。3．特异性要高于其他大多数方法。4．操作相对简单，可以在1~1.5小时内完成。缺点•由于下列因素，福林酚法在某些应用中需采用标准曲线进行校正。1．反应产生的颜色比双缩脲法更易因蛋白质的种类不同而发生变化。2．反应最终的颜色深浅并不直接与蛋白质浓度成正比。3．蔗糖、脂类、磷酸盐缓冲液、单糖和己胺会不同程度的干扰反应。4.高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基化合物会干扰反应。四、紫外吸收法原理•蛋白质在UV280nm处有强烈吸收，这是由于蛋白质中有色氨酸和酪氨酸等芳香环残基存在。由于存在于每一种食品的蛋白质中色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定，所以可用比色法，即在280nm处比色测定蛋白质的浓度。适用范围应用•简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没有广泛应用于食品体系。•已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱液或变性剂（如8M尿素）中的蛋白质测定。尽管蛋白质中的肽键在190nm~220nm处的紫外吸收比在280nm更强，但在低紫外区域的测定更困难。优点•快速，相对较灵敏（在280nm处需要100ug或更多的蛋白质，比双缩脲法灵敏数倍）。•反应不受硫酸铵和其它缓冲液的干扰。•不破坏样品原有的性质，在测定完蛋白质含量后仍然可用于其它分析。广泛用于层析柱分离后的蛋白质测定。缺点•核酸在280nm处也有紫外吸收，纯蛋白质和纯核酸的280nm/260nm紫外吸收比分别为1.75和0.5。如果知道280nm/260nm的值，就能校正核酸在280nm处的吸收值。•不同种类食品的蛋白质中，芳香族氨基酸的含量明显不同。•样品溶液必须纯净无色。•此法适用于相对纯净的体系。BicinchoninicAcid(BCA)法•原理•Smith等人提出,在碱性条件下蛋白质将铜离子还原成亚铜离子，亚铜离子-蛋白质复合物和苹果绿的BCA试剂反应形成浅紫色。反应形成颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。BicinchoninicAcid(BCA)法•方法•1．蛋白质溶液和含有BCA钠盐、Na2CO3、NaOH、CuSO4、pH11.25的BCA试剂一步混合。•2．在37℃保温30min或室温下放置2hr,或60℃保温30min。温度的选择取决于灵敏度的要求。较高的温度导致较深的颜色反应。•3．在562nm处比色读数，并做空白比较。•4.用BSA作标准曲线。BicinchoninicAcid(BCA)法•优点•BCA法已经应用于蛋白质的分离和纯化中。此法对测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。•1．灵敏度与福林酚法相似。微量BCA法的灵敏度（0.5~10ug）稍高于福林酚法。•2．一步混合的操作比福林酚法更简单。•3．所用试剂比福林酚法简单。•4．非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰。•5．中等浓度的变性剂（4M盐酸胍或3M尿素）不对反应产生干扰。BicinchoninicAcid(BCA)法•缺点：•1．反应产生的颜色不稳定，需要仔细地控制比色时间。•2．还原糖会对此反应产生的干扰比对福林酚法更大。•3．不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似。•4．比色的吸光度与蛋白质浓度不成线性关系。阴离子染色法原理•含蛋白质的样品溶于缓冲液中和已知的过量阴离子染色剂混和，蛋白质与染色剂形成不溶性复合物。反应平衡后，离心或过滤除去不溶性的复合物，再测定溶液中未结合的可溶性染色剂。•蛋白质+过量染色剂蛋白质-染色剂复合不溶物+未结合可溶性染色剂•阴离子磺酸基染色剂，包括酸性十二号橙，橙G和酰黑10B，都可以和基本氨基酸残基中的阳性基团（组氨酸中的咪唑基、精氨酸中的胍基和赖氨酸中的ε-氨基等），以及蛋白质中游离的氨基酸终端基团结合.•未结合的染色剂与样品中蛋白质的含量成反比,可用分光光度计法测定。方法•1．样品粉碎（60目或更小），加入过量的染色剂。•2．剧烈摇晃内容物加速染色反应至平衡，过滤或离心去除不溶物。•3．测定滤液中未结合染色剂溶液的吸光度，从标准曲线中计算