Real-Time-PCR实验技术

12020/11/2荧光定量PCR实验技术讲座报告人：徐歆2013.3.2022020/11/2简介工作原理试验注意点主要内容32020/11/2简介42020/11/2什么是荧光定量PCR？在PCR反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量荧光定量PCR结果可以用于定性（判断一段序列的有无），也可以用于定量（确定DNA拷贝数），即qPCR52020/11/2工作原理62020/11/2工作原理（SYBR®GREEN）72020/11/2工作原理x-轴表示PCR循环数，y-轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系82020/11/2工作原理到达相同荧光强度（R）需要的循环数（CΤ）越小，则初始模板量越多92020/11/2试验102020/11/2试验—引物的设计NCBIGenbank查询目的基因mRNA序列根据mRNA序列中的CDS设计引物要求：17~24mers，CG=40~60%,Tm≈60℃引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡结构Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出1000bp以下的非目的产物112020/11/2试验—cDNA样品的制备提取TotalRNA（培养细胞或组织）保证RNA质量（OD260/OD280=1.8~2.2）RNA尽快反转录为cDNA按实验方案稀释cDNA122020/11/2试验—加样根据待测样本及目的基因计算反应孔数目，选择96孔反应板或8联管进行试验先配制不同样本的大体系PCR反应液（引物除外），再分装至小管，加入不同引物每个样本的同一基因建议做2~3个重复孔将反应液各组分混合均匀，去除液面的气泡132020/11/2试验—程序的设置背参染料的荧光强度不随PCR反应变化，用于校正孔与孔之间的荧光干扰或反应体积变化对SYBR®GREEN荧光强度的影响142020/11/2试验—结果的查看152020/11/2试验—数据导出162020/11/2试验—数据分析（相对定量）2-ΔΔCт(Livak)法用参照基因（如β-actin）的Cт值校正目的基因的Cт值，求出ΔCт值用对照组样品的ΔCт值校正处理组样品的ΔCт值，求出ΔΔCт值相对表达比率为2-ΔΔCт，相对表达水平为2-ΔCт172020/11/2试验—数据分析（相对定量）统计软件（SPSS或SAS）对不同组的相对表达比率（2-ΔΔCт）进行多重比较（LSD、Duncan等方法）182020/11/2注意点实验方案要周密，分组设置完整，切勿遗漏，避免补做或重做引物特异性要好，扩增效率高同一基因的定量尽可能在一块板子上完成认真加样，避免失误试剂珍贵，切忌浪费192020/11/2谢谢！！！