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实时荧光定量PCRrealtime-PCRCFX96实时定量PCR仪实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累对整个PCR进程进行实时监测，进而实现对未知模板进行分析的方法。具有灵敏度高、特异性强、可靠性强，自动化程度高，无污染性，实时性，准确性等优点。定量与常规PCR的差别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。RealtimePCR原理SYBRGreenI（非特异荧光标记）TaqMan探针（特异荧光标记）Molecularbeacon（特异荧光标记）SYBRGreenI工作原理SYBRGreen1结合到双链DNA的小沟部位，只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT未结合SYBRGreen1dye变性:无荧光信号1、SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光2、变性时，DNA双链分开，无荧光3、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。TaqManProbes报告基团淬灭基团与目标序列互补FAMTETJOEHEXVICTAMRADABCYL探针完整，报告基团（R)所发射的荧光能量被淬灭基团(Q)吸收，无荧光.R与Q分开，发荧光.Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针.TaqManProbes工作原理分子信标(发夹型杂交探针)荧光基团茎由互补配对的序列组成环与目标序列互补淬灭剂茎(5-7bp)环（15-30bp）FAMTexasRed分子信标工作原理探针杂交到DNA模板光发出荧光荧光基团DNA模板淬灭剂茎环光淬灭荧光扩增曲线分成三个阶段：1.荧光背景信号阶段2.荧光信号指数扩增阶段3.平台期Baseline(基线）是背景曲线的一段，范围从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景.Threshold（荧光阈值）PCR扩增信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值。即荧光（Rn）超过本底时的临界数值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍.CT（cycleofthreshold）每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct与初始模板的关系初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少.Ct与初始模板负相关起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量.Quantificationmethods分析方法绝对定量和相对定量绝对定量已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线•主要针对样本间基因表达的差异，比如说经过处理的样本和未经处理的对照。因为不要做标准曲线，基因表达的相对变化分析比绝对定量的方法更省时，应用更广泛。•需要内标基因做归一化处理。标准的看家基因一般都可被用作内标基因。如Actin,GAPDH，β-actin,β2-microglobulin以及rRNA等。相对定量几个概念•对照组：用作对照的样本，与实验组进行比较•实验组：未知样本，用于研究•目的基因(GOI)：用于研究的基因•内参基因(看家基因)：基因表达量比较恒定的基因，用于校正起始上样量的区别•参比样本(Calibrator):用于比较的样本，如未处理样本、正常组织、0时相样本等•标准品(Standards)：梯度稀释的已知浓度的样品，测定未知样品的浓度和反应效率•Ct值：样品扩增产物的荧光信号达到所设定的荧光阈值时需要的循环数•反应效率(E)：PCR扩增的速率ActinSTAT21对照CPV202224DeltaCt#2:DeltaCt#1:22-21=124-20=41stDeltaDeltaCt:1-4=-32ndDeltaCPV样品中STAT表达量是对照的2-（-3）=8相对定量—(2-△△Ct)-Assume100%efficiency-OnlyoneRefGene相对定量—(2-△△Ct)相对定量荧光PCR实验设计定量PCR反应体系重复的样本间做一个MixPrimer与普通的PCR有区别操作规则1.全程佩戴一次性手套，皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。2.使用灭菌的Ep管，枪头等，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。3.荧光探针要避光保存，加样完毕后立即进行PCR。4.注意移液枪枪使用时的精度，所有液态要缓慢的加到管底，不要用枪吹打，加样完毕后低速离心，避免气泡产生。5.实验操作过程中尽量少说话，不能直接用手接触8联管，防止试剂污染。RealtimePCR程序参比荧光：管家荧光ROX反应结束后，逐渐加温。和SyberGreen分子结合的PCR产物随温度升高逐渐变为单链，就不能在和SyberGreen结合。一般每加温一度，读一次信号。当温度到达PCR产物的Tm时，产物解离一下增多。曲线的横坐标是温度，而纵坐标是荧光信号的变化！开始加热，信号变化不大，所以几乎是平的，接近Tm时，突然变化加大，所以出现峰值。再升温，产物全部解离，就又是一条直线了。