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细菌培养基的制备一、实验设计思想1春季传染病菌大多数为细菌，因此我们设计了细菌的培养基制备方案。2通过制备的培养基可以对细菌进行鉴定。3要对细菌进行药物研发，要了解细菌的生长条件，所以要设计制备培养基。二、实验目的1、明确培养基配制的原理及方法，了解培养基中各成分的作用；2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和方法；3、学会包扎吸管、培养皿，制作棉塞；4、了解细菌适宜的理化环境。三、实验流程按培养基配方称量----加热融化----调节pH到细菌最适值----分装与包装----高压灭菌----检查灭菌与否四、实验原理（一）培养基制备原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。微生物的六类营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水碳源：一切能满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养源。氮源：凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源。能源：能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物质，或辐射能称为能源。生长因子：是一类对调节微生物正常代谢所必需，但不能用简单的碳、氮源自行合成的微量有机物。无机盐：无机盐或矿质元素主要可为微生物提供碳源、氮源以外的各种元素。水：同一切生物一样，微生物的营养中不可缺少水。水是微生物细胞的主要化学组成之一。微生物的营养类型：光能无机营养型（光能自养型），光能有机营养型（光能异养型），化能无机营养型（化能自养型），化能有机营养（化能异养型）（二）高压蒸汽灭菌原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅的隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。五、实验药品与器材1、药品琼脂，NaCl，水，牛肉膏蛋白胨培养基的配方药品；2、仪器具刻度1000毫升搪瓷量杯或小铝锅，电子天平，试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，药匙，pH试纸，分装漏斗，试管盒，纱布，棉花，报纸，麻绳，标签，培养皿，高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉，等六、实验步骤1.实验药品称量牛肉膏,1.5g，蛋白胨5g，Nacl2.5g，琼脂10g，水500mL。2.溶解用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻璃棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。3.调节pH值借磷酸缓冲液进行调节----调节K2HPO4和KH2PO4两者的浓度比即可获得pH值在7.0~8.0之间的一系列稳定的pH值。4.过滤与分装先将过滤装置安装好，在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。固体分装装量为管高的1/5；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。5.高压灭菌手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：（1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端都不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。（4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1MPa，121.3℃，20分钟灭菌。（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。（6）将取出的灭菌培养基放入37℃温箱中培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。