第四章-植物胚胎培养及离体授粉2014

植物胚胎培养指对植物胚、子房、胚珠、胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的培养方式。第四章植物胚胎培养及离体授粉一、胚培养的意义（应用）1.促使发育不良和中途败育的胚发育成熟（胚抢救）高等植物的种间和属间进行远缘杂交时，由胚乳发育不良使杂种胚的败育。可以建立胚胎培养，在人工培养基上供应与胚乳成分类似的外源营养，以保证胚的正常发育。2.打破休眠期促使萌发胚培养可以克服种子发育上的障碍和促进胚的生长，提高发芽率、缩短育种周期或加速良种繁育。第一节胚培养3.克服多胚品种珠心胚的干扰仙人掌、柑橘等，除正常有性胚外，还配以从珠心组织发生多个不定胚。这些不定胚常常侵入胚囊，使合子胚发育受阻，影响了育种效率。4.快速繁殖良种砧木可以产生大量的次生胚，加速良种砧木的繁殖；而且胚胎发生技术是人工种子的重要基础。5.诱导胚性愈伤组织利用幼胚或胚轴，珠心组织等外植体，培养产生胚性愈伤组织，为细胞悬浮培养、原生质体分离、融合，或遗传转化提供很好的材料。6.种子生活力的测定测定休眠的种子生活力，应用一般的萌发试验需时间很长，要预先进行后熟处理。离体培养时间短。7.稀有植物的繁殖芭碧蕉是商品香蕉的一个野生亲缘物种，其种子在自然条件下不能萌发，然而通过离体胚的培养很容易产生幼苗。作为一种异常现象，有些椰子不能产生液体胚乳，而是一种肥厚的组织。由于十分罕见，价格非常昂贵，在菲律宾只有盛大宴会才供应这种果实，这种椰子的种子也只能通过离体培养才能萌发。此外，通过胚胎培养，探讨胚胎发育的机制、开展人工受精、以及胚与胚乳的相互关系等基础研究。杜鹃——种子1.材料的消毒与接种种子——95%酒精消毒——选取完好种子——70%酒精浸数S——0.1%升汞或10%次氯酸钠浸泡——无菌水冲洗——种子培养几天——剥离种胚——接种在培养基上。2.培养基成熟胚是含有根原基和茎原基以及1个或2个次生附属子叶，培养时进一步发育产生根和茎，此时在营养上相对独立，只需要提供简单的营养条件，在含有大量元素的无机盐和糖的培养基上即能生长。二、成熟胚的培养3.种胚培养的外界条件光照：黑暗。温度：25℃温度较适，但有些材料的生长需要较高的温度，如热带兰花的杂交种胚的培养，适于30℃温度；具有休眠习性的植物种胚，接种后先在4℃温度下，培养一段时间，然后转入正常温度培养。固体培养原胚指未成熟的幼胚。其离体培养技术难度较大，越早期的胚，培养越困难。其分离需在显微镜下进行。Hanning早在1904年就培养了萝卜和辣根菜的胚，发现离体胚可以充分发育，并且提前萌发形成小苗，这是世界上胚培养最早获得成功的一例。三、原胚（幼胚）培养幼胚则要求更复杂的培养基。除了一般的无机盐成分外，还要加入微量元素和生长辅助物质，不同发育时期的幼胚对培养基成分要求不同，胚龄越小培养及成份越复杂。对培养基营养的要求，认为无机氮是以硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐的形式供给，硝酸盐比铵盐好。培养基的渗透压对幼胚的发育有密切的关系。通常培养基的渗透压用蔗糖调整，也可以用甘露醇，用量在8％－12％左右（甚至18％），糖浓度过低还会引起胚早熟萌发．幼胚不同发育时期对培养基渗透压要求不一。液体培养1.基本培养基（1）生长调节剂生长素与细胞分裂素合理搭配，才能控制胚性生长，促使胚发育成熟。添加生长调节剂不当，可能改变胚胎发育的方向，转向脱分化而形成愈伤组织，或引发早熟萌发。（2）其他物质氨基酸：谷氨酰胺等；维生素：必需。硫胺素、烟酸、泛酸等；附加物：椰乳、香蕉、酵母提取物等天然有机物或活性炭。2.生长调节剂及其他附加物的影响多培养基培养：外环，较简单的培养基；中央，较复杂的培养基---接种幼胚。（异养——自养）胚乳看护培养：培养基周围放置同种或异种胚乳。胚柄的作用位于胚根一端，对幼胚的存活是关键，显著刺激胚的进一步发育。3.培养方法4.培养过程幼胚培养的关键技术取材时期幼胚剥离培养条件的控制（是否需要特殊处理）成熟或未成熟子房——70%酒精浸数S——0.1%升汞或饱和漂白粉浸10-30min——无菌水冲洗——剖出胚珠——取出完整胚——接种在培养基上。一般采用液体培养法。培养条件：20-30℃，2000Lx，10-14hr1）按正常胚胎发育途径形成植株（维持胚性生长）2）胚胎脱分化形成愈伤组织多数植物幼胚形成愈伤组织，再分化成胚状体或形成芽苗。3）胚“早熟萌发”幼胚不再发育，迅速萌发成幼苗。多数情况1个幼胚萌发成1个植株；有时因细胞分裂形成许多胚状体，进而形成许多植株，即丛生胚现象。“早熟萌发”产生畸形苗，或瘦弱发育不正常而死亡。这种畸形苗加以利用分离培养变异体，作为育种材料.5.幼胚培养的发育途径胚乳培养的最早研究始于1933年，Lampe和Mills首例进行了玉米胚乳培养。到目前为止，已有40多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等近20种植物的胚乳培养得到了再生植株。其它有的分化出芽、根、叶等或得到愈伤组织。胚乳培养：将胚乳组织从母体上分离下来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。裸子植物，胚乳是由雌配子体发育而成，是单倍体。被子植物，胚乳是双受精的产物，是三倍体，因此可以获得无籽果实。第二节胚乳培养1.胚乳外植体的制备1）胚乳较大块组织的种子，如大戟科和檀香科的植物，可直接将种子表面灭菌，无菌条件下除去种皮即可培养。2）带果实的种子（斛寄生类），取授粉几天后的幼果，表面灭菌后，无菌条件下切开幼果，取出种子，小心分离出胚乳，接种在培养基上。一、胚乳培养方法（1）愈伤组织诱导除少数寄生或半寄生植物可直接从胚乳中分化出器官，大部分被子植物的胚乳，无论是未成熟的或成熟的，都需要经历愈伤组织阶段，才能分化植株。胚乳接种后的6-10天后，不断增生成乳白色团状，成为愈伤组织。2.胚乳愈伤组织诱导及形态建成生长旺盛的愈伤组织应及时进行分化培养，此时需光。胚乳愈伤组织诱导器官的形成也可通过器官发生和胚胎发生2种途径来实现。通过胚胎发生途径获得再生植株，最早的是柑橘。通过胚胎发生途径获得再生植株的植物有檀香、橙、桃、枣、核桃和猕猴桃等。（2）形态建成（3）3倍体后代的特征1）形态特征由于被子植物的胚乳是3倍体，因此，通过胚乳培养可得到3倍体植株，产生无籽果实；或由其加倍产生6倍体植株。多倍体植株具有粗壮、叶片大而肥厚、叶色浓、花大或重瓣、果实大但结实率低的特征。这些变异性状可直接利用或作为育种材料，尤其在花卉和药用植物新品种选育方面往往有重要的利用价值。胚乳愈伤组织及再生植株的染色体数常常发生变化。如苹果（2n=34）胚乳植株根尖细胞染色体数的分布范围是29-56条，多数是37-56条，3倍体细胞只占2%-3%。同一植株是不同倍性细胞的嵌合体。染色体倍性混乱在胚乳培养中是相当普遍的。但有些植株胚乳培养，如核桃、檀香、橙和柚等，其倍性表现出相对的稳定性，这些植物的胚乳细胞往往也能长期保持器官的分化能力。2）胚乳再生植株的倍性胚乳植株染色体数目的检查取胚乳培养植株根尖、幼叶或胚乳愈伤组织，0.2-0.5%秋水仙素（或对二氯苯饱和溶液）25℃下处理4-8h，流水冲洗，卡洛氏液或FAA固定（福尔马林-酒精-醋酸混合固定液），1mol盐酸，60℃水浴下，水解10min，染色（1%醋酸洋红，3-5min）、压片（加1滴45%醋酸）、观察。胚乳的类型、胚乳愈伤组织发生的部位、培养基中外源激素的种类和水平。如猕猴桃来源于同一植株的胚乳，可以培养出三倍体和二倍体两种倍性的植株。ZT3.0mg/L+NAA0.5mg/L，愈伤组织再生2倍体植株；ZT3.0mg/L+2,4-D1mg/L，愈伤组织再生3倍体植株；影响胚乳培养细胞染色体稳定性的因素1.培养基与培养条件（1）培养基在胚乳培养中，常用的基本培养基有White、LS、MS、MT等，其中以MS使用最多。生长调节剂：2,4-D、玉米素等；天然提取物：20%番茄汁、葡萄汁、玉米汁、椰乳、水解酪蛋白、酵母提取物促进胚乳培养；蔗糖：小麦8%，枸杞5%。（2）培养条件ph4.5-6.5；光照10-12h；温度24-26℃。二、影响胚乳培养的因素胚乳培养中，通常有带胚培养和不带胚培养两种方式。带胚培养胚乳比不带胚的胚乳组织容易形成愈伤组织。当愈伤组织形成后，除去胚并不影响胚乳组织的增殖。2.胚在胚乳培养中的作用被子植物胚乳的发生方式分为核型（精核与极核受精后，只以核的分裂方式增殖）、细胞型（精核与极核受精后，以细胞分裂方式增殖）、有的精核与极核受精后，有核分裂和细胞分裂两种方式混生增殖。不论胚乳属于核型或细胞型，处于发育早期的胚乳，其愈伤组织诱导率较低。旺盛生长期是取材的最佳时期。几种植物胚乳培养的最佳时间（授粉后天数）大麦10～12天；黄瓜7～16天；小黑麦7～14天。3.胚乳发育类型和发育程度培养胚乳的首要目的是为了直接获得三倍体植株。三倍体——六倍体——生产；倍性多样性——筛选非整倍体植株；杂种胚乳——附加系和代换系——遗传育种。自1965年以来，许多植物通过胚乳培养获得了3倍体幼苗和植株。但被子植物中，培养的胚乳细胞以及得到的胚乳植株，并不都是三倍体。三、胚乳培养的应用附加系：正常染色体组添加了1或多条亲缘种染色体的品系。代换系：正常染色体被异源种属的1条或1对染色体代换后所形成的品系。一、胚珠培养胚珠是种子植物的大孢子囊，是孕育雌配子体的场所，也是种子形成的前身。分为受精胚珠和未受精胚珠。将胚珠从母株中分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以致形成幼苗的过程。第三节胚珠和子房培养（1）材料的选择和灭菌培养受精胚珠，摘取授粉时间合适的子房，如培养未受精胚珠，则在授粉前摘取子房。子房表面灭菌剖开子房壁，取出胚珠或带胚珠的胎座接种。（2）培养基对胚珠培养的影响培养基多为White、Nitsch、MS等，Nitsch使用更普遍。1.培养方法（3）胎座和子房对胚珠培养的影响带有胎座和子房对胚珠早期发育起重要作用。（4）胚发育时期的影响合子和原胚期的胚珠较难剥取和培养，对培养基的成分要求严格。原胚期：合子不均等横向分裂形成顶细胞和基细胞，分别进行纵向和横向分裂，形成4个细胞的原胚。2.培养条件固体培养基室温26℃，50-60%相对湿度，光照18hr。3.受精胚珠的发育胚珠——种子胚珠——愈伤组织将子房从母株上摘下，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。子房是雌蕊基部膨大的部分，由子房壁、胎座和胚珠组成。根据培养的子房是否授粉分为授粉子房、未授粉子房。二、子房培养1.子房的获取未授粉子房在开花前1-5天摘取子房，授粉子房在授粉后摘取子房。灭菌禾谷类幼穗表面用70%酒精擦拭即可，双子叶花蕾漂白粉液灭菌，其他植株暴露的子房须严格消毒，无菌滤纸吸干。拨开幼花，子房接种到培养基上。（一）子房培养的过程固体和液体培养基均可，26℃，50-60%相对湿度，光照16h。N6、MS、BN培养基。2.子房的培养（二）培养子房的发育子房性细胞——愈伤组织或胚状体——单倍体植株子房体细胞——愈伤组织或胚状体——二倍体植株1.胚珠受精胚珠培养目的——打破种子的休眠；挽救胚的发育以获得杂交种。未受精胚珠培养目的——获得单倍体细胞发育而来的植株。2.子房授粉子房培养目的——挽救子房内杂种胚的发育。未授粉子房培养目的——获得单倍体植株；试管受精解决杂交育种中不亲和问题。三、胚珠和子房培养的应用远缘杂交中,受精前的障碍如花粉在柱头上不能萌发；花粉管生长受抑制而不能进入胚珠，其原因是花柱太长或花粉管生长缓慢。受精后的障碍胚和胚乳之间的不亲和,或胚乳发育不良，杂种发育不成熟。第四节植物离体授粉（pollinationinvitro）离体授粉将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，所以又称离体受精（fertilizationinvitro）。1.离体柱头授粉指通过雌蕊的离体培养，使无菌花粉授于柱头上，得到含有可育的种子和果实的技术。是一种接近于自然授粉的试管授精技术。2.离体子房授粉通过