中药制剂中各类化学成分分析

第五章中药制剂中各类化学成分分析药物分析教研室第一节生物碱类成分分析一、概述生物碱是生物界除生物体必须的含氮化合物（如氨基酸、蛋白质和B族维生素等）之外的所有含氮有机化合物，因其结构中氮原子上的未共享电子对而大多具有碱性。生物碱绝大多数具有显著的生物活性，且活性是多方面的，因此中药制剂中有含有生物碱类成分的中药时，常选择该中药含有的生物碱成分作为定性定量的依据。二、结构特征和理化性质（一）结构特征生物碱大多由C、H、N、O元素组成，极少数分子中尚含有其他元素；大多结构复杂，结构类型较多，主要有杂环类、大环类、萜类、甾类及有机胺类等。结构中的氮原子有多种形式：脂氮、芳氮；季胺、叔胺、仲胺及伯胺；游离状态和与酸结合状态；还有以氮氧配位键形式存在的。此外，结构中除烷烃、羟基取代外还有羧基、酚羟基等酸性官能团及酯键的取代。（二）理化性质1、物理性状多数生物碱为结晶型固体，少数为无定型粉末，还有一些小分子生物碱为液体，例如槟榔碱、菸碱等；液体状的生物碱及个别小分子生物碱尚有挥发性甚至升华性，如麻黄碱具有挥发性、咖啡因具有升华性等。一般生物碱为无色或白色，但结构中具有较长共轭体系，并有助色团的，可显不同颜色。生物碱结构中如有手性碳原子或为手性分子的具有旋光性，并大多与生物碱的生理活性有关，通常左旋体比右旋体生理活性强。2.溶解性由于生物碱结构复杂，生物碱的溶解性也是多样化。大多数生物碱成分极性较小，游离状态下难溶于水，易溶氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等有机溶剂，与酸结合生成生物碱盐后水溶性增加，但与生物碱结合的酸不同，生成的盐水溶性也有差异，一般含氧无机酸及小分子有机酸的生物碱盐水溶性较大。季铵型生物碱、有氮氧配位键的生物碱易溶于水，液体生物碱及一些小分子固体生物碱则既溶于水也可溶于有机溶剂。含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或热苛性碱液。此外一些液体状态的生物碱和分子量较小的固体生物碱，如麻黄碱等具有挥发性。因此，以中药制剂中的生物碱为指标性成分或特征性组分测定时，要注意结合生物碱成分的不同情况采用相应的提取分离及净化方法进行前处理。3.沉淀反应大多数生物碱在酸性水溶液中可以与某些试剂生成不溶于水的复盐或分子复合物，这些试剂称生物碱沉淀试剂。生物碱的沉淀试剂根据其组成有碘化物复盐、重金属盐和大分子酸三大类。生物碱的沉淀反应可以检查中药制剂中生物碱的存在，当某些沉淀试剂与生物碱生成的沉淀组成恒定时，还可以用于中药制剂中生物碱成分的含量测定。但须注意的是中药水浸出液中尚有蛋白质、多肽和鞣质等成分，也可与生物碱沉淀试剂生成沉淀，产生假阳性从而导致错误结论。因此，用此反应进行中药制剂中生物碱成分的分析时，要用适宜的方法先行处理样品供试液，排除干扰。常用的生物碱沉淀试剂有碘—碘化钾、碘化铋钾、碘化汞钾、磷钼酸、磷钨酸、苦味酸、硫氰酸铬酸及四苯硼钠等。4．显色反应生物碱与一些浓无机酸为主的试剂反应产生不同的颜色，这些呈色反应多用于检识和区别纯品生物碱，而较少用于中药制剂中生物碱成分的分析。生物碱在一定pH条件下可与一些酸性染料（多为磺酸肽类）生成有色络合物，可被氯仿等有机溶剂定量提出；还有些结构中具有酯键的酯碱如乌头碱等可与异羟肟酸铁试剂反应产生紫红色，这些特点可用于中药制剂中生物碱成分的分析。5．碱性大多数生物碱呈碱性反应，能使红色石蕊试纸变蓝。生物碱之所以能显碱性，是因为它们分子中氮原子上的孤电子对对质子有一定程度的亲和力，因而表现出碱性。6．紫外光谱特征结构中具有共轭体系的生物碱均有紫外吸收，其中包括结构母核即为共轭体系的和只有部分结构为共轭系统的。紫外光谱的吸收峰位置除与其他化合物一样与共轭系统中助色团的种类、位置、数量有关外，需要特别指出的是，结构中的氮原子与发色团直接连接或参与发色团的生物碱，其吸收峰位置还与测定时溶剂的pH有关。三、供试液制备进行中药制剂中生物碱成分分析时，制备样品供试液可根据不同情况选用乙醇、甲醇、酸水以及碱化后直接用有机溶剂等溶剂提取，而后进行净化除去干扰成分，净化的方法主要有溶剂法、沉淀法及氧化铝吸附色谱法等。一般要根据：※分析目的物——是总碱还是单体生物碱；※主要生物碱的性质——是水溶性生物碱还是脂溶性生物碱、是强碱还是弱碱等；※欲使用的分析方法——经典的化学法、分光光度法还是色谱法等因素选择溶剂和方法。四、定性鉴别目前，用于中药制剂中生物碱成分定性鉴别的方法主要有沉淀法、薄层色谱法、气相色谱法及高效液相色谱法。其中沉淀法和薄层色谱法为《中国药典》（2005版）收载方法。（一）一般理化鉴别沉淀反应是生物碱理化鉴别常用方法，主要利用生物碱能与一些试剂生成沉淀这一特性。此反应一般在酸性水溶液中进行。由于中药制剂中成分复杂，有些成分如蛋白质、多肽和鞣质等也可与试剂生成沉淀而造成假阳性结果，因此，制备样品供试液时必须净化处理，除去干扰成分，方能用沉淀反应进行中药制剂中生物碱类成分的鉴别.（二）色谱鉴别1．薄层色谱法薄层色谱具有分离和鉴定双重作用，对于成分复杂的中药制剂用薄层色谱法进鉴别，可得到满意的、可靠的鉴别效果。吸附剂:硅胶或氧化铝薄层色谱，展开剂:多用氯仿、苯等低极性溶剂,加入其化溶剂调整展开剂的极性.由于硅胶显弱酸性,强碱性的生物碱在硅胶色谱板上能形成盐,使Rf值很小或拖尾,形成复斑.在硅胶吸附薄层色谱中,常用碱性系统或在碱性环境下展开.显色剂:常用改良碘化铋钾试剂,有时喷碘化铋钾试剂之后再喷硝酸钠试剂,可使样品斑点更加清晰.亦可用碘蒸气、硫酸铈、碘铂酸等其化的试剂显色.2．纸色谱法纸色谱法可用于生物碱盐或游离碱的鉴别，主要是以水为固定相的正相纸层析，分离效果常取决于流动相的性质。中药制剂中生物碱纸色谱的显色剂基本和薄层色谱法的相同，但含硫酸的试剂不适用。五、含量测定生物碱成分含量测定的方法早期常用酸碱滴定法、沉淀法等经典的化学方法.近年多采用分光光度法、薄层色谱法及高效液相色谱法等.（一）总生物碱含量测定化学分析法主要使用酸碱滴定法;强碱滴定生物碱盐时,在70%-90%的乙醇介质中终点比在水中明显,因此常将生物碱盐溶于90%乙醇,再用标准碱乙醇液滴定.若选择的溶剂及指示终点方法合适,还可用非水滴定法进行.分光光度法分光光度法1、直接测定不经过化学反应,利用生物碱物质自身的光吸收直接进行比色测定的方法;一般用于药味较少、干扰不大的中药制剂中总生物碱的含量测定;2、离子对萃取比色法酸性染料比色法应用本法的关键在于介质的pH、酸性染料的种类和有机溶剂的选择;常用的酸性染料有甲基橙、溴麝香草酚兰（BTB）和溴甲酚绿等;pH的选择要根据染料的性质及生物碱的碱性(pKa)大小来确定;选择有机溶剂的原则是根据离子对与有机相能否形成氢键以及形成氢键能力的强弱而定.氯仿、二氯甲烷与离子对形成氢键,有中等程度的提取率,且选择性也较好,故是常用的提取溶剂.苦味酸盐比色法在弱酸性或中性溶液中生物碱可与苦味酸定量生成苦味酸盐沉淀,该沉淀可溶于氯仿等有机溶剂,也可以在碱性条件下解离释放出生物碱和苦味酸.雷氏盐比色法雷氏盐(NH4[Cr(NH3)2(SCN)4]·H2O)在酸性介质中可与生物碱类成分定量地生成难溶于水的有色络合物.异羟肟酸铁比色法含有酯键结构的生物碱,在碱性介质中加热,酯健水解,产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸,再与Fe3+生成紫红色的配合物(异羟肟酸铁),在一定浓度下符合Beer定律,可用比色法进行含量测定.（二）单体生物碱的含量测定1、薄层色谱法生物碱不具有紫外吸收或挥发性时可用本法测定.选用的吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别相似,但要求比鉴别严格.使用改良碘化铋钾等作为显色剂时,必须完全挥干展开剂后(尤其在碱性环境下展开时)才可喷洒,否则背景深,反差小,影响测定.2、高效液相色谱法以反相高效液相色谱应用较多;在反相高效液相色谱中,由于硅胶表面残留硅醇基的影响,使生物碱分析易产生保留时间延长、峰形变宽、拖尾.可采取改进流动相、固定相等措施以克服游离硅醇基的影响,满足定量定量分析的要求.中药制剂中生物碱成分时行高效液相色谱法测定时,使用较多的是紫外检测器.3、气相色谱法只适用于有挥发性的、遇热不分解的生物碱类;生物碱盐在急速加热过程中产生的酸对色谱柱和检测器不利,应该注意;制备供试品溶液时一般应采用冷提取,净化过程也要避免加热,以防成分流失,最后需用氯仿等低极性有机溶剂为溶媒制备成供试液.（三）常见生物碱成分分析中药制剂中含有生物碱成分的中药较多，含有的生物碱成分也很复杂，但作为定性定量的指标性成分。第二节黄酮类成分分析一、概述黄酮类化合物（flavonoids）是广泛存在于自然界的一大类化合物。多具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。黄酮在藻类、菌类中很少发现；苔藓植物中大都含有；蕨类植物比较普遍存在；裸子植物中也含有但类型较少；黄酮类化合物最集中的是被子植物，类型最全，结构最复杂，含量也高。由这些中药参与配伍的中药制剂也较多见。二、结构特征及理化性质（一）结构特征黄酮类化合物是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物，现在则是泛指两苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。根据基本结构又可分为黄酮、黄酮醇、双黄酮、异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、橙酮、花青素、黄烷等类型。多数黄酮结构中存在有桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系，故在200-400nm波长区域内有强烈的吸收带，此是光谱法及色谱—光谱法分析的基础。大多黄酮及其苷类含有游离酚羟基，可与聚酰胺形成氢键，可用聚酰胺色谱法进行分析。（二）理化性质1、物理性状黄酮类化合物多为晶性固体，少数（如黄酮苷）为无定形粉末。游离的苷元中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外，其余则无。苷类由于在结构中引入糖的分子，故均有旋光性，且多为左旋。2、溶解度黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态（苷或苷元，单糖苷、双糖苷或三糖苷）不同而有很大差异。游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶或不溶于苯、氯仿等。3、酸碱性酸性：黄酮类化合物因分子中多有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。碱性氧原子的性质黄酮类化合物分子中γ-吡喃酮环上的1-位氧原子，因有未共用的电子对，故表现出微弱的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，常表现出特殊的颜色，可用于鉴别。生成的盐极不稳定，加水后即可分解。4、显色反应还原反应：与盐酸—镁粉（或锌粉）反应，金属盐类试剂的络合反应：黄酮类化合物分子中多有下列结构，故常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐等试剂反应，生成有色络合物。OHOoOOHOHOH铝盐：常用试剂为1%三氯化铝或硝酸铝溶液。生成的络合物多为黄色（λmax=415nm）,并有荧光，可用于定性及定量分析。铅盐：常用1%醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液，可生成黄至红色沉淀。据此不仅可用于鉴定，也可用于提取及分离工作。锆盐：多用2%二氯氧化锆甲醇溶液。黄酮类化合物分子中有游离的3-或5-OH存在时，均可反应生成黄色的锆络合物。但两种锆络合物对酸的稳定性不同，当反应液中接着加入枸橼酸后，5-羟基黄酮的黄色溶液显著褪色，而3-羟基黄酮溶液的呈鲜黄色（锆—枸橼酸反应）。5、紫外光谱特征黄酮类由于具有2-苯基色原酮的基本结构，具有特定的紫外吸收峰，常有两个较强的吸收带，I带在300—400nm范围内，它是由于B环桂皮酰基引起的，Ⅱ带为240—285nm范围内，它是由于A环上的苯甲酰基引起的。黄酮类化合物当加入一些位移试剂如甲醇钠、醋酸钠、氯化铝等，可使最大吸收波长发生位移，选择性提高，还可消除杂质的干扰，有利于含量测定。三、定性鉴别（一）显色反应黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及γ-吡喃酮环有关。常用盐酸-镁粉（或锌粉）反应与金属盐类试剂的配合反应黄酮类化合物分子中有游离的3-