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一步一步教你使用NCBI查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST序列比对等作者�urbest2007-8-1苏州大学生命科学学院一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 2 最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST进行序列比对……�这些问题在NCBI上都可以方便的找到答案。现在我就结合我自己使用NCBI的一些经历�经验�跟大家交流一下BCBI的使用。希望大家都能发表自己的使用心得�让我们共同进步�我分以下几个部分说一下NCBI的使用�Partone如何查找基因序列、mRNA、PromoterParttwo如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列Partthree运用STS查找已经公布的引物序列Partfour如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主�将这个帖子置顶�从发帖到现在�很多战友对该帖给与了积极的关注�在此向给我投票的�以及想给我投票却暂时不能投票的�各位战友表示真诚的感谢�谢谢各位战友�请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。关于NCBI其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充Firstofall�还是让我们从查找基因序列开始。第一部分利用Mapviewer查找基因序列、mRNA序列、启动子�Promoter�下面以人的IL6�白细胞介素6�为例讲述一下具体的操作步骤1�打开Mapviewer页面�网址为�在search的下拉菜单里选择物种�for后面填写你的目的基因。操作完毕如图所示�2�点击“GO”出现如下页面�一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 3 3�在步骤二图示的右下角有一个QuickFilter,下面是让你选择的几个复选框�在Gene前面的小方框里打勾�然后点击Filter.出现下图�说明一下�1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。2、下面参考序列给出了三个�是不同的部门做出来的�经我验证�序列有微小的差异�但总体来说基本相同。尽管你分别点击后�序列代码、序列代码等有所差异�但碱基基本一致�不影响大家研究分析序列。现在普遍采用的是最上面的那个序列�这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的一个序列。我也推荐大家使用这个序列。一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 4 4�点击上述三条序列第一条序列�即reference�对应的Genesseq�出现新的页面�页面下方为�5�点击上图出现的“Download/ViewSequence/Evidence”�即下载查看序列等功能�结果如图所示�先对上面这张图做点简要的说明�在SequenceFormat�序列输出格式�后面是一个下拉式选择菜单�默认的为FASTA格式�还有一个是GenBank格式。我推荐大家选择GenBnak格式�因为这个格式提供了很多该基因的信息�而FASTA格式只有基因序列。6�在SequenceFormat后选择GenBank�然后点击下面的Display�目的基因的相关信息和序列就出现在眼前了。点击后如图所示�网页较大�只抓取一小部分以作示范��一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 5 在上述打开的网页中�你可以看到基因长度�基因序列�以及这个基因是如何被报道出来的等各种信息。你会看到:mRNAjoin(3598..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057,7803..8394)这代表了从基因的3598位开始就是转录区了�即我们常说的mRNA片断�由于内含子的存在�所以mRNA在DNA序列上分成了几段。CDSjoin(3660..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057,7803..7970)CDS代表编码序列�即蛋白编码区是从3660开始的�ATG��由于剪接作用所以CDS区也是不连续的。说到这里�可能很多朋友都已经明白了promoter即启动子区域在哪里了。但我还是再唠叨几句�转录起始位点前面是基因的调控区�启动子区没有明显的位置定义�大家也只是猜测它的大体位置�如果你要研究promoter区的话�建议你选择转录起始位点前的2000个碱基进行研究�一般默认的是这样。当然你如果觉得长度太长不好研究的话�也可以只研究-1000到0这一千个碱基�因为一般情况下�启动子区的变异都在这个区域内。这样大家就可以找到自己的目的基因序列和启动子了�这种方法可能使用的人不是很多�但我个人比较喜欢�因为它最大的优点是可以找到启动子区域和其他调控区域。希望大家可以发帖交流�让我们把NCBI用的更好�一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 6 第二部分如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列�依然以人类的IL6为例�1�进入NCBI主页�在search后面选择Gene�在for后面填写需要查找的基因的名字。如图所示�点击“Go”�出现以下界面�出现了很多基因序列�在每个序列的右边还有“OrdercDNAclone”的链接�这些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的�有些是别名�OtherAliases�与你的目的基因一致�根据每个序列的介绍认真选择你的目的基因。上图中我需要的IL6是标号为2的序列。2.1查找cDNA序列2.1.1点击OrdercDNAclone,出现目的页面如图所示�一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 7 2.1.2点击CloneSequence后面的链接即可得到cDNA序列。点击后如图所示�只抓取其中一部分��2.2查找mRNA、蛋白序列回到步骤1点击“Go”之后出现的页面�点击目的基因的名字�出现以下页面(只抓取一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 8 相关部分)�页面的下半部分�即可以获取mRNA和蛋白序列的部分�找到“NCBIReferenceSequences(RefSeq)”�它分为几个板块�第一个“mRNAandProtein”区可以让我们找到连续的编码mRNA序列和蛋白序列。在mRNAandProtein一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 9 下面有两个序列代码�中间划有一个箭头��这代表了mRNA序列和蛋白序列。分别点击就可以得到相应的序列页面。点击后如图所示�mRNA序列�蛋白序列如下�NCBIReferenceSequences(RefSeq)的第二个板块是Referenceassembly�它下面显示的是Genomic�点击Genomic下面Referenceassembly对应的Genbank或FASTA即可出现编码的DNA序列�注意�只是编码序列�其中包括内含子�但一般没有5‘非编码区�。这一步就不做贴图演示了吧�呵呵。这样我们就可以找到基因的cDNA序列、连续的编码mRNA序列、蛋白序列以及含有内含子的编码DNA序列了。相信这些操作对很多战友还是有用的。如果大家有更好的方法�欢迎发帖交流�友情提示�在NCBI里打开的每一个页面都会给我们提供大量的信息�大家不妨好好看看�可能会有令我们惊喜的收获�最后唠叨一句�最近我实验比较忙�只能在深夜发帖�可能要过几天再发第三部分[Partthree运用STS查找已经公布的引物序列]�希望“期待下集”的朋友可以理解。一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 10 第三部分运用STS查找已经公布的引物序列STS�序列标签位点�SequenceTaggedSite��一段短的DNA序列�200�500个碱基对��这种序列在染色体上只出现一次�其位置和碱基顺序都是已知的。在PCR反应中可以检测处STS来�STS适宜于作为人类基因组的一种地标�据此可以判定DNA的方向和特定序列的相对位置。以上内容基本是STS的定义�我主张活学活用�下面就介绍一下我个人用STS数据库查找引物的一点经验。还是使用人的IL6基因为例�呵呵1�打开NCBI主页�在Search后面的下拉菜单选择UniSTS�在FOR后面填写目的基因。操作完毕如图所示�点击GO以后出现以下页面�这是你会发现NCBI又提供了很多序列�下面我们还是要初步筛选我们需要的序列。一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 11 2�根据物种、目的阴物所在染色体的位置等选择相应序列�可能不只一个��点击。下面以点击第一个进入的画面为例。你会发现这个页面直接就给出了引物序列�PCR之后的片段长度也是给了的�247bp�。下面还有很多相关的信息……3�点击GeneBankAccession后面的代码�进入下一个页面。一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 12 啊�前后引物都呈现在眼前了�还有反应体系和反应条件�其中PrimerA是前引物序列�PrimerB则是后引物序列�并且给出了他们在DNA序列中的位置。有兴趣的朋友可以在序列中找一下�是可以找到的�不过要注意�PCR是双链扩增�在序列中可以直接找到的是PrimerA的原序列和PrimerB的互补序列。在步骤二里面我只点开了一个序列�继续打开其他的可能还会有对自己有用的引物�不过这要你自己慢慢发掘了。这种寻找引物的方法有点投机取巧的味道�实用程度不是很高�但如果这里面恰好有你想P的片段的话�恭喜你�这些引物都是很成熟的引物�可以直接拿过来使用了。如果想寻找引物�大家可以查阅相关论文�已经报道的引物我们为什么不用呢��既省时间�可靠性又强。如果这两种方法都不能找到你需要的引物的话�那就自己设计吧�建议使用Primer5和Oligo。引物设计的详细内容我在这里就不多说了�推荐两个帖子给大家看一下�第一个是本版版主liuzeyi2002发起的�内容很丰富�很值得学习�另一个则是我发的。=64&id=9517792&sty=1&tpg=1&age=0=67&id=9523263&sty=1&tpg=1&age=0一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 13 第四部分如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性提到序列比对�绝大多数战友都会想到BLAST�但BLAST的使用确实又是一个很大的难题�因为他的功能比较强悍�里面涉及到的知识比较多�而且比对结束后输出的结果参数�指标�又很多。如果把BLAST的使用详细的都讲出来�我想我发帖发到明天也发不完�更何况我自己也不是完全懂得BLAST的使用。所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列为例来给大家介绍一下BLAST的使用�也算是BLAST的入门课程吧。请看帖的战友好好体会�如果你用心看�在看帖完毕之后BLAST的基本使用�包括其他序列的比对�应该没有问题了。1�打开BLAST页面�打开后如图所示� 对上面这个页面进行一下必要的介绍�BLAST的这个页面主体部分�左面�包括了三部分�BLASTAssembledGenomes、BasicBLAST、SpecializedBLAST。相信大家可以看懂这三个短语的意思�我就不多说了�我要说的是�可以认为这是三种序列比对的方法�或者说是BLAST的三条途径。第一部分BLASTAssembledGenomes就是让你选择你要比对的物种�点击相应物种之后一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 14 即可进入比对页面。第二部分BasicBLAST包含了5个常用的BLAST�每一个都附有简短的介绍。第三部分SpecializedBLAST是一些特殊目的的BLAST�如IgBLAST、SNP等等�这个时候你就需要在SpecializedBLAST部分