第四章酶的提取与分离纯化

第四章酶的提取与分离纯化TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的提取与分离纯化定义将酶从细胞或其它酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所需酶制品的技术过程，主要包括细胞破碎、提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取(粗提)酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质(crudeprotein):采样→均质打破细胞→抽提出全蛋白，多使用盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2)部分纯化(partiallypurified):初步的纯化，使用各种柱层析法。(3)均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPLC。酶分离纯化不同阶段第一节细胞破碎（CellDisruption）细胞破碎：是通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程。表4-1细胞破碎方法及其原理分类细胞破碎方法细胞破碎原理机械破碎法捣碎法研磨法匀浆法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎物理破碎法温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法反复冻融法干燥法通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎化学破碎法添加有机溶剂、添加表面活性剂通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎酶促破碎法自溶法外加酶制剂法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎一、机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法1、机械捣碎法：器械：捣碎机。常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞破碎，也可用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。一、机械破碎法2、研磨法器械：研钵、细菌磨等。设备简单，效率较低，常用于微生物和植物组织细胞的破碎。一、机械破碎法3、匀浆法器械：匀浆器。通常用于破碎那些易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞，细胞破碎程度较高，其机械切力对酶的破坏也较少，但难于在工业生产上应用。二、物理破碎法各种物理因素：温度、压力、声波等的作用，使组织细胞破碎的方法。多用于微生物细胞的破碎。1、温度差破碎法利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用使细胞破碎。温度差破碎法对那些较脆弱、易破的细胞破碎效果好，但在酶的提取时，不能在过高的温度下操作，以免酶失活。此法难以用于工业生产。2、压力差破碎法（1）高压冲击法（2）突然降压法取决因素：a.压力差b.压力减低的速度c.细胞种类和生长期此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌效果较佳，最好使用对数生长期的细胞。高压细胞破碎机步骤：高渗平衡→转入低渗溶液→低渗溶胀破裂适用范围：膜结合的酶、细胞间质酶等的提取无壁或壁破坏（3）渗透压差法3、超声波破碎法超声波：通常人的耳朵可听到的声音频率范围为16-20kHz，频率高于20kHz的波。其破碎机理可能与空化现象引起的冲击波和剪切作用有关。在超声波作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。由于空化作用而使液体形成局部减压引起液体内部发生流动，旋涡生成与消失时，产生很大的压力使细胞膜破裂到达破碎细胞的效果。JY92-IID超声波细胞粉碎机超声波细胞粉碎机（液晶显示）超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。影响因素：细胞浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等。必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。一般操作条件为：音频10kHz或20kHz；功率100～150W；温度0～10℃；pH4～7；处理时间3～10min，最好间隔几次操作；细胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破碎。细胞浓度一般以1g湿菌体加1～2mL缓冲液为宜。3、超声波破碎法超声波破碎法特点：处理少量样品时操作简单、快捷、液量损失少、效果好；是最常用的物理破碎法，特别适用于微生物细胞的破碎。超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却剂进行冷却。4、反复冻融法将待破碎的细胞放在低温下（-15～-20℃）突然冷冻，然后在室温（或40℃）下缓慢地融解，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需反复多次。在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。5、干燥法多种方法使细胞干燥，如气流干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活性物质变性。三、化学破碎法应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破碎的方法。某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物质有选择地渗透出来。三、化学破碎法化学破碎法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成，不同化学试剂对各种微生物作用的部位和方式有所不同。常用的化学试剂：有机溶剂和表面活性剂1、有机溶剂能破坏细胞壁中的类脂。常用试剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞外。2、表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。例如，TritonX-100（特里顿）是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，其作用主要是破坏内膜的磷脂双分子层，从而使某些胞内物质释放出来。表面活性剂处理法对膜结合酶特别有效。在酶的提取方面一般不采用离子型表面活性剂的原因：离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，引起酶的变性失活。如何除去表面活性剂？可采用凝胶层析，以免影响下一步分离纯化。化学破碎法的优点：A、对产物释放具有一定选择性。B、细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。化学破碎法的缺点：A、通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。B、时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50％。C、有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中，需设法分离除去。四、酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法。1、自溶法（Autolysis）将发酵液在一定pH值和适宜温度条件下保温一段时间，由于胞内自身酶系破坏细胞以释出胞内酶的方法。自溶条件：温度、pH值、离子强度等。自溶时间一般较长，不易控制，为防止其他微生物在自溶液中滋长，必要时可加入甲苯、氯仿、叠氮钠等杀菌剂。还可以通过加入噬菌体去感染细胞，或通过电离辐射等方法，使细胞自溶。自溶法的缺点：易引起所需蛋白质的变性；自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降；易引起杂菌或噬菌体感染。2、外加酶处理根据细胞外层结构的特点，选用适当的酶，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。利用外加酶或细胞本身存在的酶也可使细胞破碎。破坏微生物细胞壁的酶：溶菌酶、葡聚糖酶、几丁质酶等；破坏植物细胞壁的酶：纤维素酶、半纤维素酶等。酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。酶溶法的不足：1、溶酶价格高，限制了大规模应用，若回收溶酶则又需要增加分离纯化溶酶的操作和设备，其费用也不低；因为加入的溶菌酶、几丁质酶等价格高，而且外加酶本身混入细胞破碎液中成为杂质，所以只适于实验室采用。2、酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确定最佳的溶解条件。机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理破碎细胞的不同分类方法破碎细胞的不同分类方法破碎细胞方法：动植物细胞：高速组织捣碎机组织匀浆器微生物细胞：机械破碎法酶法化学试剂法物理破碎法等多种。第二节提取（Extraction）酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂：极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。第二节提取（Extraction）为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶一、提取的方法1、盐溶液提取盐溶现象：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。原因：盐浓度较低时，蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，使蛋白质与水分子间的相互作用加强，因而溶解度提高。如：淀粉酶、蛋白酶等胞外酶可用0.14mol/L的氯化钠溶液提取注：但有少数酶，如霉菌产生的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。2、酸溶液提取有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。如：从胰脏中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可用0.12mol/L的H2SO4。提取时要注意溶液的pH值不能太低，以免使酶变性失活。胰蛋白酶：pI10.5最适pH7.8-8.53、碱溶液提取有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用碱溶液提取。注意事项:操作时要注意pH值不能过高，以免影响酶的活性。加碱液的过程要一边搅拌一边缓慢加进，以免出现局部过碱现象，引起酶的变性失活。4、有机溶剂提取一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取效果较好。原因:丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10％，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中的溶解能力大大增加。提示：一些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。例如，胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8％乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.5～3.0进行提取。从下面三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：①6.8％的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca2+；③选用pH2.5～3.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。还可除去一部分在稀