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1CRISPR—Cas基因组改造技术研究进展郭嘉海1王奇奇2邹虎山3（1.生物技术1班学号：121303109，2.生物技术1班学号：121303110，3.生物技术1班学号：121303111）摘要：CRISPRs—Cas系统是一种细菌获得性免疫系统，为一段规律成簇间隔短回文重复，保护细菌和古生菌免遭病毒、质粒等的入侵。这种免疫系统是由一种小RNA和多结构域蛋白质／蛋白复合物构成，其作用机理可能与真核生物的RNA干扰过程类似。这个系统已发展为一种高效、特异、操作简单易行的基因修饰工具，与TALEN、ZFN相比．CRISPR—Cas系统的出现使得基因编辑变得更加有效和简易，具有更大的潜力。CRISPR／Cas系统已成功应用到细胞、干细胞、小鼠、斑马鱼及植物等多种生物，显示了其强大的基因编辑优点[1]。综述了CRISPR—Cas系统的技术原理及其在生物学研究中的应用最新研究进展，并探讨了该技术的发展前景。关键词：规律成簇间隔短回文重复(CRISPRs)；内切酶；同源重组机制；非同源末端连接机制；脱靶效应；Abstract：CRISPRs—Casistheelucidationoftheprokaryoticadaptiveimmunesystemandclusteredregularlyinter-spacedshortpalindromicrepeats，whichprotectsbacteriaandarchaeaagainstvirusesorconjugativeplasmids．Theimmuni—tvsvstemconsistsofbacteriaRNAmoleculesandversatilemulti—domainproteinsorproteincomplexes，whichmaybesimi—lartothemechanismofRNAinterferenee．CRISPR—Casinterfefencemachinesareutilizedtodevelopintoagenomeedit—ingtoolswithefficiency，specializationandsimplicity．DistinctfromTALENandZFN，theCRISPR-Cassystemhasrecent—lyemergedasapotentiallyfacileandefficientalternativet001．Currently．researcheshavealreadymodifiedthegenomeofcell，IPS，mouse，zebra，fishandplantwiththissystemthatshowpowerfulabilitytoeditgene．ThetechnicalprinciplesofCRISPR—CassystemandthelatestprogressontheapplicationinbiologicalstudyofCRISPR／Cassystemwasreviewed，andthedevelopmentfutureofthesystemwasdiscussed．Keywords：clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPRs)；endonuclease；homologousrecombi—nation；non—homologousendjoining；off-targeteffect.CRISPRs(Clusteredregularlyinterspacedshortpa—lindromicrepeats)为规律成簇间隔短回文重复，是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构[2-3]。CRISPR通过与一系列相关蛋白、前导序列一起，为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫能力。这种结构的作用机理可能与真核生物的RNA干扰过程类似，最早于1987年在大肠杆菌(Escherichiacoli)K12的i印基因侧翼序列中被发现[4]。21CⅪSPR—Cas技术原理CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列组成，重复序列的长度通常为21.48bp，重复序列之间被26～72bp间隔序列隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列与靶基因进行识别睁[1]。Cas(CRISPRassociated)：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在向导RNA(guidanceRNA)引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。CRISPR—Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫，而这种特异性是由间隔序列决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR间隔序列的动态性变化(即通过增加或删除间隔序列)来实现的[4]。与TALEN、ZFN不同，CRISPR—Cas系统的出现使得基因编辑变得更加有效，具有更大的潜力。在细菌中，CRISPR参与协助一些细菌躲避哺乳动物免疫系统。目前已经发现3种类型的CRISPR—Cas系统，这3种类型可根据Cas位点基因组织源性的不同来区分。这3种类型进一步又可分成10种亚型，并表达针对干扰的不同蛋白复合物。虽然有很多CRISPR—Cas系统需要多种蛋白的参与，但是在很多细菌的胞内都只需要Cas9内切酶就足够，这种CRISPR—Cas系统被称作2型系统(TypeIIsystems)，2型系统以Cas9蛋白以及向导RNA为核心，即CRISPR—CasRNA引导核酸酶(CRISPR—CasRNA—guidednuclease，CRISPR—CasRGN)，Cas9内切酶是一种DNA内切酶，很多细菌都可以表达该蛋白，Cas9内切酶能够为细菌提供一种防御机制，避免病毒或质粒等外源DNA的侵入。在二型CRISPR—Cas系统中，短链外源DNA整合在CRISPR基因组中，转录加工成CRISPRRNA(crRNA)，这些crRNA参与反式调控激活crRNA(tracrRNAs)．指导Cas蛋白特异性位点剪切致病DNAtnl。然而，最近有研究发现，这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA(single—guideRNA，sgRNA)[6]。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。研究表明，Cas9蛋白对靶序列的识别需要的是crRNA中一段种子序列及与靶DNA序列互补的序列(PAM序列)。Cas9内切酶在向导RNA分子的引导下对特定位点的DNA进行切割，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制(homologousrecombination)或者非同源末端连接机制(non—homologousendioining)对断裂的DNA进行修复。如果细胞通过同源重组机制进行修复，会用另外一段DNA片段填补断裂的DNA缺口，因而会引入一段新的遗传信息。并且可通过设计不同crRNA，使得CRISPR—Cas系统能剪切不同的DNA序列[7-9]。CRISPR—Cas系统可以通过共转染表达Cas9蛋白及crRNA的质粒带人到任意人类细胞中。另外，这种RNA引导的DNA内切酶具有复杂的基因干扰能力。还可以定向整合到IPS细胞中。3Cas9内切酶还可以转换成其他内切酶，能对DNA修复机制进行更多的调控。但是还需要更多的研究来证明这种系统的工作能力及潜在的脱靶影响．尤其是在复杂的基因组中，CRISPR—Cas系统是否具有识别特异性单一位点的能力。CRISPR系统如何避免自身免疫的发生在研究CRISPR/Cas系统的过程中有一个很重要的问题．宿主菌利用crRNA与靶序列配对结合介导外源DNA切割，而crRNA本身是由宿主菌的基因组为模板转录出的pre-crRNA经加工后形成的，这就是说相同的靶序列也存在于宿主的基因组中，那么CRISPR/Cas系统应该有一套机制将自身序列和外源的靶序列区分开．最近表皮葡萄球菌里的一项研究发现了CRISPR系统区分靶点和自身基因组的方法．在表皮葡萄球菌里面成熟的crRNA除了spacer以外在其5'端和3'端包含有部分repeat序列[10]。当外源DNA入侵宿主菌时，crRNA扫描到外源DNA上的靶序列(protopacer)并与之配对结合，但靶位点两端的序列不能发生配对，对于宿主菌基因组中相同序列的“protospacer”来说，crRNA除了能与“protospacer”配对外，两端的repeat序列也能与“protospacer”两侧的基因组DNA完全配对，实际上只有不完全的配对才允许核糖核蛋白复合体发挥切割活性，通过这样的机制CRISPR/Cas系统避免自我免疫[54]．另外，在研究稻白叶枯黄杆菌中的CRRISP/Cas系统时发现，虽然在宿主菌的CRISPR中的spacer序列能够与噬菌体Xop411一段靶序列完全配对，但宿主菌对噬菌体Xop411依旧不抵抗，分析发现是噬菌体protospacer临近的PAM(proto-spaceradjacentmotifs)突变引起，这说明外源DNA的protospacer序列临近的PAM对CRISPR/Cas系统识别外源DNA的必要性[53]．宿主菌的CRISPR基因座位的间隔序列(spacer)临近位置不存在PAM，这也是CRISPR系统能够区分自身DNA和外源DNA避免发生自身免疫的原因之一．2CRISPR—Cas技术应用2．1在细胞水平上的应用从实际应用的角度来看，CRISPR—Cas系统比TALENs更容易操作．因为每一对TALENs都需要重新合成。而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。其中2型CRISPR—Cas系统(RNA介导的Cas9系统)由于其简便性而应用得更多。Cho等。研究发现。对化脓性链球菌编码的Cas9内切酶进行改造之后也可以让它们在人类细胞的细胞核中被活化，然后再搭配针对人体DNA序列设计的长约20bp的双RNA复合体或者sgRNA就可以对人体基因组进行定点切割和改造。这套Cas9系统能在多种人体细胞包括诱导多能干细胞预定的DNA位点进行基因组双链DNA切割，并存在后续的修复现象，成功率高达38％，并且Cas9内切酶对4细胞几乎没有毒性并能以非常高的效率对普通的基因组位点进行定向基因替换的操作。Jinek等发现这套RNA介导的Cas9系统还能够在人体细胞内诱发位点特异性的基因组修饰行为，而且Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的行为是这套位点特异性的基因组修饰过程中的限速步骤。麻省理工学院张峰的研究团队利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对哺乳动物基因组上两个基因进行编辑等利用TALENs和CRISPRs对细胞基因组同一基因进行修饰，效率分别为0％～34％和51％～79％，并且后者还较容易生成纯合子突变克隆(总克隆的7％～25％)[11]。2．2在生物体水平上的应用CRISPR—Cas系统除了能应用在细胞学研究上外，研究者发现Cas9系统还可以对生物体进行基因组改造的操作。2013年1月，洛克菲勒大学的研究者利用CRISPR—Cas系统将设计好的DNA模板替换相应基因来达到基因的定向修饰120]。他们用这种方法对肺炎链球菌和大肠杆菌进行基因突变，发现100％的肺炎链球菌和65％的大肠杆菌带有突变，证实了这种方法可以用于细菌的基因组修饰。借助这一技术可以对各种微生物进行遗传学改造．打造出符合人类需要的工程微生物．使其造福人类，在生物能源或生物制药等诸多领域具有极大的应用潜力。同时马萨诸塞州综合医院的研究者利用人工合成的sgRNAs指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰，并证明取得与ZFN一样的修饰效果。他们将编码Cas9蛋白的mRNA和特定的向导RNA(与斑马鱼基因组DNA的匹配机率高达24％．59％)注射