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快速有效筛选目标微生物的新方法—宏基因组的构建及应用专业：微生物学学号：20101028姓名：张爱平宏基因组学•第一节什么是宏基因组学•第二节宏基因组学技术流程•第三节宏基因组学的应用第一节什么是宏基因组学背景知识：迄今，人们对微生物世界的认识基本都来源于对占细菌总种数不到1％的微生物的单个种群的孤立研究结果。然而微生物是通过其群落而非单一种群来执行在自然界物质与能量循环中的作用的，对微生物群落作为整体的功能认识远远落后于对其个体的认识。这种状况不利于全面认识微生物在自然界所扮演的重要角色。为了获得完整的环境微生物基因表达产物，早在1978年许多学者就提出了直接从环境中提取微生物DNA的思路，1998年，ARIADpharmaceutical公司的科学家Handelsman等首次提出宏基因组的概念。•宏基因组(thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature)是指生境中全部微生物基因的总和。它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和，微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。•宏基因组学(metagenomics)是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法，也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。它主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能，为充分认识和开发利用非培养微生物，并从完整的群落水平上认识微生物的活动、最大限度地挖掘微生物资源提供了可能第二节宏基因组学技术流程•从环境中提取宏基因组DNA；•用核酸内切酶切割成一定长度的DNA片段并连接到合适的载体上；•转化宿主菌，形成一个重组的DNA文库即宏基因组文库；•宏基因组文库筛选。一、环境样品DNA提取提取步骤通常需要满足两个条件：①尽可能提取样品所有微生物的基因，②保持片段的完整和纯度。目前所开发的DNA提取方法有两种：细胞提取法和直接裂解法直接裂解法：物理法：冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法化学法：常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等酶裂解法依据提取样品总DNA前是否分离细胞，可以分为原位裂解法和异位裂解法。1、原位裂解法（直接提取法）原位裂解法是在环境样品中加入DNA提取缓冲液，使细胞裂解然后从样品中直接提取DNA并纯化的方法。优缺点：该法提取的DNA产量较高，操作容易、成本低，但纯度低，腐植酸等污染严重，往往还需要经过纯化处理才能满足后续分子生物学操作的需要，此外，由于机械剪切作用较强，提得的DNA片段长度有限（1-50Kb），常适用于构建小片段插人文库(以质粒和噬菌体为载体)的DNA提取。2、异位裂解法•异位裂解法是先把微生物细胞从环境样品中分离出来，再从微生物细胞提取DNA并纯化。•优缺点：所得的DNA纯度较高，但DNA产量及所包含的基因组信息的广泛性不及直接提取法并且操作繁琐、成本高、得率低。间接提取法提得的DNA片段长度相对较长（20-500Kb），适合构建黏粒（cosmid）文库和细菌人工染色体（BAC）文库。•二、宏基因组文库构建1、载体系统选择常用的克隆载体有:质粒载体(如pUC18和pUC19)，插入片段一般小于10kb；Cosmid(黏粒载体，如pWE15)，插入片段30～45kb；BAC(细菌人工染色体，如pBeloBAC11)，插入片段大于100kb。选择合适的载体系统，应考虑以下因素:所提DNA的质量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的载体拷贝数、使用的宿主以及筛选方法等。如对腐殖质含量较高或剪切较严重的DNA样品适宜构建质粒文库，小片段的文库适用于筛选新的与代谢相关的单基因或小操纵子。而对于含较大基因簇或大片段的DNA样品则适宜构建Cosmid、Fosmid或BAC文库，从而筛选由较大基因簇编码的复杂代谢途径或能够表征环境中未培养微生物基因组的较大基因片段。2、宿主系统选择宿主菌株的选择主要考虑：转化效率，重组载体在宿主细胞中的稳定性，宿主能否为相关功能基因提供必需的转录表达体系，对异源表达基因产物提供必需的转录表达体系，对异源表达基因产物是否有较强的相容性，以及目标性状(如抗菌性)及缺陷型等因素。研究表明，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。鉴于7O%的抗生素来源于放线菌的事实，若以寻找抗菌、抗肿瘤活性物质为目标，选择链霉菌为宿主较理想；而筛选新的酶则采用大肠杆菌为宜。3、转化在宏基因组克隆中，所谓转化是指通过适当的方法使宿主细胞处于感受态，从而摄取重组DNA的水平方向的基因转移过程。其方法有CaC12法和电穿孔法。CaC12法即用高浓度的Ca2+诱导细胞使其成为能摄取外源DNA的感受状态，该方法自建立以来已广泛用于以大肠杆菌为受体的重组质粒的转化，但该方法转化效率不高。电穿孔法是用高压脉冲电流击破宿主细胞膜或击成小孔，从而使外源DNA由小孔进入细胞，该方法转化效率较高。三、宏基因组文库筛选1功能驱动的筛选2化合物结构水平的筛选3序列驱动的筛选4底物诱导的筛选1功能驱动的筛选功能驱动的筛选(Function-drivenscreening)即基于活性的筛选。是根据重组克隆产生的新活性而进行筛选的方法。优点：只要基因能在宿主中表达，就可以根据基因表达特性进行筛选，能迅速找到可用于工农业和医药业的酶等蛋白质和抗生素等天然产物；缺点：目的基因必须能在宿主中进行功能表达，而基因表达与否除了和宿主有关外，还决定于基因本身的完整性，这就要求一方面要选择合适的宿主菌株，另一方面要求克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中基因的某个组件遭到破坏将使基因无法表达，也就不能根据表型加以筛选。筛选工作量大、效率低。2化合物结构水平的筛选化合物结构水平的筛选(Screeningoncompoundstructure)是根据不同结构的物质在色谱中有不同的吸收峰值，通过比较转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图，筛选产生新结构化合物的克隆子。这一方法可直接筛选到新结构化合物，但不一定有生物活性，且工作量大、成本高。3序列驱动的筛选序列驱动的筛选(Sequence-drivenscreening)是根据已知功能的基因序列设计探针或PCR引物，通过核酸杂交或PCR扩增来筛选具有目标序列的克隆子。优点：不依赖克隆基因在宿主菌株中的表达。缺点：必须对相关基因序列有所了解，无法筛选宏基因组文库中那些和现有基因序列完全不同的新基因(即未知基因)。PS：通过DNA微阵列技术(基因芯片技术)寻找环境基因组序列中的有用片段也是一种全新的筛选技术，它可以快速有效的识别和描述许多菌落的特征，并可应用于大量保守基因的分离。基于序列的筛选策略可以利用基因芯片技术大大提高筛选效率，有可能筛选到某一类结构或功能的蛋白质中的新分子，但必须对相关基因序列有一定的了解，较难发现全新的活性物质。4底物诱导的筛选底物诱导的筛选(Substrate-inducedgeneexpressionscreening，SIGEX)是利用合适的底物进行诱导，使克隆子分解代谢基因表达来进行筛选的方法。优点：为高通量筛选提供了保障，而且不需要对底物进行修饰；可以从底物推断出未知的酶，进而推断基因的功能;缺点：对目标基因的结构性和适应性很敏感，用于诱导的底物必须要进入细胞质，若不能进入细胞质，则无法诱导目的基因的表达；但是某些基因的表达不仅受底物诱导，还可受其他因子的诱导；某些基因无需诱导即能表达；某些本可诱导表达的基因由于宿主的改变而无法诱导表达。而且FACS（荧光激活细胞分拣术）对进样设备的要求也比较高。1、在生态学方面的应用宏基因组在生态学上的应用主要是土壤与水体。目前其在土壤微生物研究中的应用主要包括两方面：一、进行土壤微生物及其资源的挖掘。目前的研究工作已经得到大批新基因，特别是在一些极端环境中的微生物宏基因组的研究中得到了一些具有特殊应用价值的功能酶基因二、揭示土壤微生物的多样性及其与环境之间的关系。在水体中的应用：海洋蕴涵着非常丰富的微生物资源，目前已应用宏基因组技术研究了多种海洋次生代谢产物合成途径，其中最为经典的是研究海洋聚酮类和非核糖体肽类的生物合成基因簇。2、在新型生物催化剂中的应用新型催化剂主要是酶。传统的新型酶的筛选方法限制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学则克服了这一限制，有效地提高了新酶的筛选效率。现已发现了抗生素及维生素生物合成相关基因簇的克隆，以及水解酶类和氧化还原酶类编码的基因。宏基因组技术通过对环境的直接克隆，为研究和利用占微生物99％以上的非培养微生物提供了新的途径，为微生物的研究和发展提供了全新的策略。3、人类宏基因组测序人类宏基因组即人体所有共生微生物遗传物质的总和。利用能够容纳大插人片段的克隆载体，尽可能地将人体全部共生微生物的基因组进行克隆，从而构建出人类宏基因组文库。据估计，人类宏基因组计划可能发现的新基因将超过100万个，这对于许多疾病发生机理的阐明、新药的研发、药物毒性的控制等都将产生重大影响。小结宏基因组学为人类开发利用未培养微生物提供了新的思路和途径，随着宏基因组学技术的发展和新的思路和途径以及宏基因组学技术的发展和完善，其应用领域将更加广阔，更多的工业用酶将被商业化。宏基因组学具挑战性的一项长远目标是面对大量宏基因组序列片断的指数式递增，通过邻接片段(Contigs)及染色体步移(walking)和亚克隆(clonetoclone)等手段重建那些尚未被培养的微生物的基因组。