(完整版)现代生命科学与生物技术-07基因技术

1第7章基因技术2本章内容7.1基因克隆技术7.2基因测序技术7.3基因重组技术7.4生物制造2020/11/637.1基因克隆技术概念：由少量（单拷贝）基因扩增产生大量（高拷贝）基因。分子克隆策略：化学合成－已知序列（60－80bp）;生物合成（基因扩增）(已知部分或全部序列)；文库筛选应用：测序，功能研究，诊断与检测，物质生产…7.1.1基因克隆2020/11/647.1.2PCR原理与技术1、原理1971，Kleppe等首先描述了基因合成的基本原理PCR技术发明人：KaryMullis（Cetus公司）1983，构想DNA链的合成。1985，Klenow片段扩增出哺乳动物单拷贝基因1993，获得诺贝尔化学奖。聚合酶链式反应：Polymerasechainreaction，PCR分子生物学技术，生物体外，扩增一段DNA片段。通常不超过10kb,特定方法扩增40kb左右。2020/11/65PCR原理：在DNA聚合酶催化下DNA的复制过程，利用反复相同程序，DNA聚合酶在体外扩增特定的DNA片段。变性94℃退火55℃延伸72℃第1轮第2轮第3轮指数增加2020/11/66加热方式：水加热，空气加热，电热丝加热，半导体+电热丝致冷方式：水致冷，空气致冷，压缩机致冷，半导体致冷温控系统仪器构造：三传感器，双区域温度--温度梯度样品池传感热敏元件热泵热池2、PCR仪原理计算机芯片控制过程参数2020/11/67ThePCRJetfromMegaBasegivesfastPCRwithlargesamples.2、PCR仪，热循环仪Morereactionsinthesamespacewith1,536wells2020/11/683、操作过程•PCR反应的基本组分：DNA模板：含靶基因的DNA片段引物：1对人工合成的短寡核苷酸，18－25bp，决定扩增的起始和终止位置及扩增长度DNA聚合酶：作用是催化合成复制扩增的区域底物：4种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，A、T、G、C缓冲体系:提供适合聚合酶行使功能的化学环境。•石蜡油：防止蒸发；管盖（可加热）封闭反应管2020/11/69PCR的条件与循环参数第1步：25－40个循环，变性(94-96℃，1-2min)——退火（降低温度使得引物结合到模板的特定序列上。55℃，1-2min)——延伸（DNA聚合酶由引物的3端开始，沿着DNA链合成新的互补链。72℃，1000bp/min)。第2步：强化延伸，72℃，7－13min第3步：终止反应（4℃）PCR反应在热循环仪（PCR仪）中自动化进行。反应控制：温度的加热或冷却过程，关键是每步反应温度精确，升温和降温的时间控制。10PCR产物的电泳结果2020/11/6117.1.3PCR技术应用进展•原理没有变，技术改进，派生出多种类型和用途。•基因克隆方面：反转录PCR(RT-PCR)：以RNA为模板，基因扩增多重PCR(multiplexPCR)：同一反应中使用多组引物，扩增多个基因2020/11/612gcgtacgtacgtagagtgctagtctagtcgtagcgccgtagtcgatcgtgtgggtagtagctgatatgatgcgaggtaggggataggatagcaacagatgagcggatgctgagtgcagtggcatgcgatgtcgatgatagcggtaggtagacttcgcgcataaagctgcgcgagatgattgcaaagragttagatgagctgatgctagaggtcagtgactgatgatcgatgcatgcatggatgatgcagctgatcgatgtagatgcaataagtcgatgatcgatgatgatgctagatgatagctagatgtgatcgatggtaggtaggatggtaggtaaattgatagatgctagatcgtaggtagtagctagatgcagggataatgcgcatta…….7.2基因测序技术基因是由A、T、G、C4种碱基组成基因组测序就是排列出其DNA上所有碱基顺序。2020/11/6137.2.1核酸测序技术简史•1965，HolleyR等：测定酵母tRNA全部77bp的序列。•1971，Wu,Taylor：dNTP，λDNA黏末端12bp。•1973，Gilbert和Maxam，RNA聚合逆转录DNA，RNA测序。•1975,Sanger:加减法测定了X174DNA的6386bp序列。•1977，Sanger：酶法测序。双脱氧链终止法。PNAS。•1977，Maxam和Gilbert：化学降解法测序。PNAS。•1980，Messing等:测序优化，计算机数据处理。•1982，Hood等:部分自动化，荧光检测，PCR测序。•1990，自动测序仪，测序酶，配套荧光染料，机器人高通量工具，人类基因组测序启动。•2000，毛细管测序仪，机器人使用，加速测序•2005－2007，以GenomeSequencerSystem、GenomeAnalyzersystem、SOLiDSystem为代表的基因组测序分析系统的诞生，标志着进入超高通量基因组测序的新时代。2020/11/6147.2.2传统测序技术（1）产生长度只差1bp的一系列寡核苷酸：固定起点，随机终止于特定一种或者多种残基（A、T、C、G）。长度由特定碱基在DNA上位置所决定。（2）检测长度只差1bp的一系列寡核苷酸：SDS－PAGE电泳分离，发光成像。（3）确定序列：放射性（32P、33P）、荧光（非放射性荧光），直接读出DNA上的核苷酸顺序。•产生只差1bp寡核苷酸方法，分两种：Sanger双脱氧链终止法，Maxam-GilbertDNA化学降解法。1、基本原理2020/11/6152、Sanger双脱氧链终止法2020/11/6162、Sanger双脱氧链终止法2020/11/6173、Maxam－GilbertDNA化学降解法•开始：Gilbert研究lac抑制子与lac操纵基因。•发现：抑制子结合并保护操纵子DNA，用Sanger建立的RNA测序技术测定了DNA片段序列。•灵感火花：苏联Mirzabekov到访，午餐讨论，是否与DNA的甲基化有关，产生了化学测序技术。•1977：测序技术，PNAS，74：560－564•DNA片段一端用放射性标记，用碱基特异性的化学反应裂解DNA，通过标定末端与断裂位点之间的距离来确定碱基的位置2020/11/618原理•末端标记DNA：放射性同位素•化学修饰碱基：硫酸二甲酯甲基化G；甲酸甲基化A和G；肼水解C和T，盐抑T，•哌啶切割：链断裂，一组从1－300bp不等的末端标记分子。•5组独立反应：每组特异针对某一种或某一类碱基。生成5组产物，共同起点（放射性标记末端）到发生化学降解的位点。•电泳分离，放射自显影。•读出序列：比较G、A＋G、C＋T、C和AC各个泳道，从测序凝胶放射自显影片上读出DNA序列。2020/11/619Maxam-GilbertvsSanger•MG法：刚问世时，重现性更高，化学试剂，易掌握。•Sanger法：单链模板和特异引物，高质量DNA聚合酶•噬菌体和噬菌粒载体的发展，聚合酶，标记技术，合成引物及测序反应日臻完善，机器人等自动化。•Sanger法：简便快速，现今测序的最佳方案。•MG法应用:基因功能研究。2020/11/6202020/11/621………ATGCCGTAGGCCTAGCTAGGCCTAGCTCGGA……………ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA……基因组DNABAC文库根据物理图谱正确定位的BAC或contig用于霰弹法测序的候选克隆用于霰弹法测序的亚克隆测序并组装完整的基因组序列逐步克隆法（ClonebyClone）全基因组霰弹法（WholeGenomeShot-gun)基因组DNA霰弹法克隆测序并进行全基因组序列组装完整的基因组序列2020/11/622毛细管检测：ABI公司的3100凝胶电泳检测:美国LI-COR公司的4300系统2020/11/623•3730XL系列DNA分析仪MegaBACE1000毛细管测序仪2020/11/624测序效率•1977：4×50bp（样品/人/周×可读平均长度）•1980：20×100bp（荧光标记）•1985：30×250bp•1990:60×300bp（PCR引入）•1995：180×500bp•1999:500×650bp•2000：5000×600bp荧光素标记的终止物ddNTP；单向测序长度保证700－900bp。1.5kb序列，双向反应，一次读通，免去引物合成。2020/11/6251994：3亿美元测定一个人类基因组(1:10)1984：30亿美元测定一个人类基因组未来目标：1000美元测定一个人类基因组(1:3x106)2004：3千万美元测定一个人类基因组(1:100)2006：150万美元测定一个人类基因组(1:2000)未来目标：100美元测定一个人类基因组(1:3x107)2020/11/6267.2.3高通量测序技术主要测序方法：焦磷酸测序技术：Roche公司的GSFLX系统（454系统）；桥扩增测序技术：Illumina公司的GenomeAnalyzer系统（Solexa系统）；连接测序技术：ABI公司的SOLiD系统；2020/11/6277.2.3高通量测序技术主要应用领域：未知物种基因组的从头测序已知物种的重新测序环境基因组测序基因转录组和表达调节sRNA分析染色质免疫共沉淀SNP等多个领域。2020/11/6281、焦磷酸测序技术2005年底，罗氏诊断公司和454公司推出了基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——GenomeSequencer20System(GS20)。2007年推出了通量更大，读长更长，准确性更高的第二代基因组测序系统——GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)。2020/11/629PPiATPPyrosequencing技术原理每延伸1个核苷酸，释放出1个焦磷酸焦磷酸在磺酰化酶作用下生成ATP荧光素酶利用ATP把无荧光的分子转化为荧光物质，化学发光，监测。1、焦磷酸测序技术2020/11/630Nucleotidesdispensedsequentially12345678910110-1AAGCTGThesequenceinthispyrogram™isAGGCAGAGGCAG无需加ddNTP，随着反应的进行而同步读出序列。2020/11/631SingleimageDNA聚合酶APSATPPPiLight+OxyluciferinsulfurylaseluciferaseEmulsionBasedClonalAmplification2020/11/632OpenMachine、SequenceGenome光学系统计算机系统微流体系统多道吸口试剂泵、阀CCD照相机pl板2020/11/633The454Tech2007年3月Roche公司收购了454公司，推出了新一代高通量测序仪GSFLX系统。10小时内完成一个测序反应，单反应读长由100bp扩展到400bp，准确性达99％产出数据量达1亿碱基对。每次运行可分析16个非混合的独立样品。J.D.Watson的基因组的测序。2020/11/634GenomeAnalyzer•Illumina公司于2007年推出。•读序原理：可逆性末端终结反应。•在桥扩增过程，四种碱基底物分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭。•单次反应只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应颜色。然后，除去该保护基团，以使下一个碱基的延伸反应继续进行。•反复多轮反应，按顺序可排出DNA的序列。2、桥扩增测序技术（Solexa）2020/11/6352、桥扩增测序技术原理：基因组DNA片段化，两端添加接头；单链DNA片段被固定在特殊芯片上形成单