(整理)动物生物化学实验指导

--------------------------动物生物化学实验指导（修订版）武汉工业学院--------------------------生物化学实验室规则1．每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。2．实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。3．实验过程中要听从教师的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经教师检查同意，方可离开实验室。4．实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用完后，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。5．使用仪器、药品、试剂和各物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教师，不得擅自动手检修。6．实验室内严禁吸烟！加热用的电炉应随用随关，严格做到：人在炉火在，人走炉火关。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。实验完毕，应立即拨去电炉开关和关好水笼头，拉下电闸。离开实验室以前应认真、负责地进行检查水电，严防发生安全事故。7．废液体可倒入水槽内，同时放水冲走。强酸、强碱溶液必须先用水稀释。废纸屑及其他固体废物和带渣滓的废物倒入废品缸内；不能倒入水槽或到处乱扔。8．要精心使用和爱护仪器，如使用分光光度计时，不能将比色杯直接置于分光光度计上，并注意拿放比色杯时，不要打碎。仪器损坏时，应如实向教师报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。9．实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁带出室外，借物必须办理登记手续。--------------------------实验一唾液淀粉酶活性的观察原理酶是指化学本质为大分子的生物催化剂。在一定条件下，酶促化学反应进行的能力即酶活性。影响酶活性的因素是多方面的，如温度、pH及某些化学物质等都会影响酶的催化活性。在一定条件下，能使酶活性达到最高时的温度即酶的最适温度，而能使酶活性达到最高时的PH即酶的最适PH。例如，唾液淀粉酶的最适温度是37℃，而其最适PH是6.8。能增高酶活性的物质称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶因变性而丧失活性。酶活性通常是通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察的。本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受理化因素影响的情况，唾液中含有唾液淀粉酶，唾液淀粉酶的底物是淀粉。淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解，从而得到各种糊精乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。而碘液能指示淀粉的水解程度——淀粉遇碘呈紫色、暗褐色与红色，而麦芽糖与葡萄糖遇碘则不呈颜色反应，如图所示：淀粉淀粉酶糊精淀粉酶麦芽糖+少量葡萄糖加碘后：（蓝色）（紫红色、暗褐色或红色等）（棕黄色、碘本身颜色）试剂及器材：1.试剂（1）0.5%（w/v）淀粉溶液：称取0.5g可溶性淀粉，加少量预冷的蒸馏水，在研钵中调成糊状，再徐徐倒入约90mL沸水，同时不断搅拌，最后加水定容为100mL即成。要求新鲜配制。（2）稀碘溶液：称取1.2gI2、2gKI，加少量蒸馏水溶解后，再加蒸馏水至200mL。保存于棕色瓶中，用前5倍稀释。（3）不同pH溶液：A液----0.2mol/LNa2HPO4溶液：称取35.62gNa2HPO4.12H2O，将之溶于蒸馏水后定容至1000Ml。B液----0.1mol/L柠檬酸溶液：称取19.212g无水柠檬酸，将之溶于蒸馏水后定容至1000Ml。①pH5.0缓冲液----取A液10.3ml、B液9.7mL混合而成。②pH6.8缓冲液----取A液14.55ml、B液5.45mL混合而成。③PH8.0缓冲液----取A液19.45ml、B液0.55mL混合而成。配好缓冲液后应用酸度计验证。（4）0.5%（w/v）蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，将之溶于蒸馏水后定容至100mL。（5）斑氏试剂：A液-----称取无水CuSO417.4g，将之溶于100mL预热的蒸馏水中，冷却后用蒸馏水稀释至150ml。B液-----称取柠檬酸钠173g、Na2CO3100g，再加蒸馏水600mL，加热溶解后冷却，用蒸馏水稀释至850mL。--------------------------将A液与B液混合即得斑氏试剂。（6）1%（w/v）NaCl溶液：称取NaCl1g，将之溶解后用蒸馏水稀释至100mL。（7）1%（w/v）CuSO4溶液：称取无水CuSO41g，将之溶解后用蒸馏水稀释至100Ml。2.器材（1）白瓷板（或比色板）（2）恒温水浴锅（3）电炉操作1、唾液淀粉酶应用液的制备（1）每人取一个干净的饮水杯，装上蒸馏水。（2）先用蒸馏水漱口，将口腔的食物残渣清除干净。（3）口含约20mL蒸馏水，做咀嚼动作1-2分钟，以分泌较多的唾液。然后将口腔中的唾液吐入一个干净的小烧杯中。（4）取一块干净的白瓷板，按表1-1进行实验。表1-1穴号试剂（滴）1234567蒸馏水222222弃去唾液2222220.5%淀粉222222碘液（滴）111111结果（颜色）以呈棕红色者浓度为准，稀释原唾液作应用液。2、温度对酶活性的影响（1）取3支试管，按表1-2进行实验。表1-2试管编号1230.5%淀粉（mL）555PH6.8缓冲液（mL）0.50.50.5稀释唾液（mL）0.50.50.5不同温度（℃）置冰水浴中置37℃水浴中置沸水浴中将各管中的试剂加好后混匀，然后及时在上述温度下分别进行处理。（1）在干净的比色板上，于各孔穴中分别滴加2滴碘液。（2）每隔1分钟从第2支试管取反应液1滴，与比色板孔穴中的碘液混合，观察颜色的变化。（3）待第2支试管中的反应液与比色板孔穴中的碘液混合后颜色不再变化时，取出试管，并将在沸水浴中处理的试管用冷水冷却，然后向各试管中滴加碘液1-3滴。摇匀后观察并记录各管颜色，比较各管中淀粉水解的程度，说明温度对酶活性的影响。--------------------------3、pH对酶活性的影响（1）取3支试管，按表1-3编号后进行实验。表1-3管号0.5%淀粉（mL）123222不同浓度pH缓冲液（mL）PH5.02----PH6.8--2--PH8.0----2稀释唾液（滴）101010摇匀后，将各管置于37℃水浴中处理。（2）每隔1分钟从pH6.8的试管中取出1滴反应液滴于白瓷板上，随后滴加稀碘液1滴，观察其颜色变化。（3）待颜色呈棕色时，向各管中加稀碘液1-3滴。观察各管颜色，比较各管中淀粉水解的程度，解释pH对酶活性的影响。4、酶反应的特异性（1）取2支试管，按表1-4编号后进行实验。表1-4试管号120.5%淀粉（mL）2--0.5%蔗糖（mL）--2稀释唾液（mL）11（2）摇匀后，将各管置于37℃水浴中处理10min。（3）取出试管，分别加入斑氏试剂2mL，混匀。（4）将各管置于沸水浴煮沸2-5min。观察并解释结果。5、激活剂与抑制剂对酶活性的影响（1）取3支试管，按下表编号后进行实验。试管号1230.5%淀粉1.51.51.5PH6.8缓冲液（ml）0.250.250.251%NaCl溶液（ml）—0.5—1%CuSO4——0.5蒸馏水（ml）0.5——稀释唾液0.50.50.5摇匀后，将各管置于37℃水浴中处理。（2）每隔1分钟从第1支试管中取出1滴反应液滴于白瓷板上，随后滴加稀碘液1滴，观察其颜色变化。（3）待颜色呈棕色时，取出3支试管，向各管中加稀碘液1-3滴。观察各管颜色，并解释之。--------------------------实验二血清总蛋白的含量测定原理本法所用试剂因能与双缩脲(H2NOC－NH-CONH2)产生紫红色反应而被称为双缩脲试剂。实际上凡分子内含有两个氨基甲酰基(-CONH2)的化合物，不论是直接相连或是通过一个氮或碳原于间接连接，均能与双缩脲试剂发生反应。蛋白质分子内含有许多肽键(—CONH—)，因此可用双缩脲法作比色测定。不含—CONH2，但含有-CSNH2、-C(NH)NH2或—CH2NH2等基团而具类似结构的化合物对双缩脲试验亦呈阳性，所以本反应并非为蛋白质所特有。但在体液中，除蛋白质外实际上不存在可与双缩脲试剂显色的物质。各种血浆蛋白质，包括病理的和正常的，呈色的程度基本相同，因此在血浆蛋白的比色测定中，双缩脲反应是较为理想的方法。NHONHNHONHCCNHONHONHCC加热180C?o+NH2222223紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：试剂和器材一、试剂双缩脲试剂：称取硫酸铜(CuSO4·5H2O，A．R．或C．P．)1．50g、酒石酸钾钠(NaKC4H406·4H2O，A．R．或C．P．)6.0g，分别用蒸馏水约250ml溶解后，全部转移于1L容量瓶中，混和，再加入10％氢氧化钠溶液300ml，随加随摇匀。最后用蒸馏水稀释至1L。保存于塑料试剂瓶中或内壁涂一层纯净石蜡的普通试剂瓶中。如无红色或黑色沉淀出现，此试剂可长期使用。二、标准和待测蛋白质溶液--------------------------1.标准蛋白溶液10mg/ml牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。2.待测蛋白质溶液血清（稀释10倍）。测试其他蛋白质样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。三、器材试管，试管架，恒温水浴，721型分光光度计。操作方法1、取7只试管，按下表加入试剂：管号0123456酪蛋白标准液/ml0.20.40.60.81.0-蛋白浓度/(mg/ml)2.04.06.08.010.0-未知样品液（ml）-----1.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20.0-双缩脲试剂/ml4.04.04.04.04.04.04.02、摇匀，室温（15－25℃）下，放置30min。3、以0管调零，在540nm波长处将各管溶液进行比色，读取各管光密度值（重复三次）。4、取测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。5、6号管从标准曲线上查出待测样品蛋白质含量，即为样品液的蛋白质含量（mg/ml）。注意事项（1）本实验方法测定范围1－10mg蛋白质。（2）须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。（3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。--------------------------实验三氨基酸的纸上层析与氨基酸移换作用原理层析分离技术是一种物理的分离法。利用待分析混合物中各组分的物理化学性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中。所谓“相”是指一个系统中的某一均匀部分。一般来说，其中一相是固定的，称为固定相，另一相是流动的液体或气体，称为流动相，两相互相接触。待分析混合物的各组分以不同的速度移动，从而分离。纸上层析是以滤纸作为支持物，滤纸总保持一些水分（约20～30％），使水称为层析中的“固定相”。另一种和固定相不能混合或部分混合的溶剂则为“移动相”。把欲分离的物质加在纸的一端，并使流动相借重力及滤纸的毛细现象移动，此时，待分离溶质因分配系数不同而逐渐分布于滤纸的不同部位。层析结束时，用显色剂使被分离的物质显出颜色，成为一个个色斑。分配在固定相中趋势较大的成分在纸上随流动相移行的速度就小，色斑距原点的位置就较近。反之，分配在固定相内趋势较小的成分移行就远，色斑位置离原点也远。溶质在纸上的移动速率可用比移（Rf）表示之。各种氨基酸在一定的溶剂、一定的纸质及其他有关条件（湿度、PH等）固定情况下