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紫外-可见光分光光度法一、技术原理紫外-可见分光光度法是在190〜800mn波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmix。物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。二、浓度测定基本原理朗伯一比尔（Lambert-Beer）定律是分光光度法的基本原理。当一束单色光通过一均匀的溶液时，一部分被吸收，一部分透过，设入射光的强度为I0，透射光强度为I，则I/I0为透光度，用T表示。当溶液的液层厚度不变时，溶液的浓度越大，对光的吸收程度越大，则透光度越小。即：-lgT=a1*c（式中a1为常数，c为浓度）当溶液浓度不变时，溶液的液层厚度越大，对光的吸收程度越大，则透光度越小。即：-lgT=a2*b（b为液层厚度）将以上两式合并可用下式表示：lgT=a*b*c研究表明：溶液对光的吸收程度即吸光度（A）又称消光度（E）或光密度（OD）与透光度（T）呈负对数关系，即：A=-lgT故A=a3*b*c（a3为吸光系数）。上式为朗伯比尔定律，其意义为：当一束单色光通过一均匀溶液时，溶液对单色光的吸收程度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。三、仪器的矫正和检定1.波长矫正常使用高氣酸钦溶液校正双光束仪器，以10%高氯酸溶液为溶剂，配制含氧化钬（Ho2O3)4%的溶液，该溶液的吸收峰波长为241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。仪器波长的允许误差为：紫外光区±1nm，500nm附近±2nm。2.吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀释至1000mL，在规定的波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，应符合表中的规定。3.杂散射的检查可按下表所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定。4.对溶剂的要求含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使用波长为205nm。另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在测定供试品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂置1cm石英吸收池中，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质）测定其吸光度。溶剂和吸收池的吸光度，在220〜240nm范围内不得超过0.40，在241〜250nm范围内不得超过0.20，在251〜300nm范围内不得超过0.10，在300nm以上时不得超过0.05。四、测定法1.注意事项测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池，在规定的吸收峰波长±2mn以内测试几个点的吸光度，或由仪器在规定波长附近自动扫描测定，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确。除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内，并以吸光度最大的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸光度读数，以在0.3〜0.7之间为宜。仪器的狭缝波带宽度宜小于供试品吸收带的半高宽度的十分之一，否则测得的吸光度会偏低；狭缝宽度的选择，应以减小狭缝宽度时供试品的吸光度不再增大为准（注释1）。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸光度后应减去空白读数，或由仪器自动扣除空白读数后再计算含量。当溶液的pH值对测定结果有影响时，应将供试品溶液的pH值和对照品溶液的pH值调成一致。2.含量检测1)标准管法将待测溶液与已知浓度的标准溶液在相同条件下分别测定A值，然后按下式求得待测溶液中物质的含量。CT=（AT/AS）*CS2)标准曲线法先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测定出它们的A值，以A值为横坐标，浓度为纵坐标，作标准曲线。在测定待测溶液时，操作条件应与制作标准曲线时相同，以待测液的A值从标准曲线上查出该样品的相应浓度。3)吸收系数法当某物质溶液的浓度为1mol/L，厚度为1cm时，溶液对某波长的吸光度称为该物质的摩尔吸光系数，以ε表示。ε值可通过实验测得，也可由手册中查出。已知某物质ε值，只要测出其A值再根据下式便可求得样品的浓度：c=A/ε。注释1：样品对光是有选择性吸收的，也就是说只吸收特定的波长，当狭缝宽度宽的时候，会有相邻的波长进入样品使单色光纯度降低，它们不被吸收或只有少量吸收，所以会使吸光度下降。当狭缝宽度减小时，单色光纯度提高，吸光度会接近真值，也就是说理论上单色光越纯，误差越小，但受制造水平限制，狭缝宽度还不能太小。