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分子生物学之植物中的应用及其进展1、前言：在植物系统与进化研究中，单纯的以植物的形态特征为依据会产生很多困难。植物外部形态有很大的伸缩性，杂交、多倍体和无融合生殖存在常常是原来的清楚的形态界限变得模糊。所以，分子生物学中的一些技术手段在其中可发挥明显的作用，可以应用到遗传学结构、遗传多样性、繁育系统，标本鉴定、推断等方面。至今，分子生物学的技术手段在不断的发展，逐渐的完善，如常用的一项技术：分子标记技术。2、参考文献：[1]陈全求,詹先进,蓝佳祥,EST分子标记在基因组学中应用的研究进展[2]王磊,宿红艳,吕少磊,八个灵芝属菌株的分子标记与亲缘关系鉴定[3]张慧,张苏江,大白菜隐性细胞核雄性不育恢复基因BrMs_f3的标记[4]王艳红,胡超群,凡纳滨对虾EST微卫星标记初步筛选[5]赵勇锋,宋战全,分子标记辅助选择下的玉米回交群体农艺性状分析[6]查仁明,杨正林,赵芳明,分子标记遗传效应预测杂交水稻产量性状[7]高志民1李雪平1李岚,分子生物学技术在观赏植物上的应用[8]苏晓田,孟凡丽,矫天育分子生物学技术在药用植物研究中的应用现状[9]李春楠，傅巧娟分子生物学技术在一串红中的应用[10]刘遵春周瑞金果树分子遗传作图研究进展[11]杨燕张春利红粒春小麦穗发芽抗性鉴定及相关分子标记的有效性验证[12]赵煦泓,尤文雨,崔海峰茭白黑粉菌核相变化及ISSR分子标记[13]谭婷婷，刘立锋利用分子标记鉴定萝卜细胞质雄性不育种质的研究[14]熊翠玲陈大福付中民蜜蜂球囊菌检测分子标记的灵敏性测定[15]宁永强丁沃娜朱世华水稻短根突变体ksrl的遗传分析和基因定位3、1）EST是长约150---500bp的基因表达序列片段。反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克隆,对其3’或5’端进行一步法测序，所获序列与基因库中已知序列进行比较，从而获得对生物生长、发育、代谢、繁殖、衰老死亡等一系列生理生化过程认识的技术。EST标记反映了基因的编码部分，可以直接获得基因表达的信息。杨新全等人采用基因组卫星SSR和EST-SSR分子标记，对28分普通小麦13分斯皮尔托小麦的遗传差异进行了分析，交过表明普通小麦的体内多态性最高。可表明，这种技术在遗传多样性中有重要作用。此项研究发现了EST-SSR揭示出的多样性明显低于SSR，但从图谱和聚类结构上看，EST-SSR标记能更精确的反映出小麦基因之间的遗传和亲缘关系。Varshney等人在大麦的研究当中，用EST-SSR来检测在多代回交和自交选择过程中，表明起再次方面也有明显的优势。2）RAPD谱带分析。采用MarkerDL2000标准分子量确定各条谱带分子量的范围，选择重复性好且稳定的扩增谱带进行分析。电泳图谱中每条谱带代表有关随机引物与模板DNA互补结合的一对位点，将它作为一个单位，即一个相应的RAPD位点，无带的赋值为0，有带的赋值为1。利用POPGENE软件计算菌株间遗传距离，基于此遗传距离再按算术平均数非加权成组配对法(UPGMA方法)聚类分析，构建各菌株的遗传距离聚类图。传统的灵芝分类法以形态特征为依据，其结果易受环境条件的影响，往往使经验丰富的学者也难以把握。通过拮抗反应可以使真菌菌种的分类鉴定变得更简单、直观。但通过实验我们发现该方法对于亲缘关系比较近的菌株往往不能有效区分，只能作为一个比较粗略的分类法。而采用RAPD技术检测、鉴别灵芝栽培菌株，是以遗传物质为依据的，鉴别上具有可靠性，同时，RAPD的灵敏度较高，能够鉴别亲缘关系较近的菌株。利用RAPD技术在分子水平上分析了八个灵芝菌株的遗传多样性，更具体、细致和客观地了解了所研究菌株的遗传背景，进而利用系统进化理论做出更为合理的分类。3）SRAP标记是Li和Quiros（2001）开发出来的一种新型分子标记，该标记扩增稳定，操作简便，扩增条带较多，适于基因标记、遗传多样性分析等。本研究共筛选SRAP引物800对，并利用SRAP与AFLP引物组合筛选328对。在获得的标记中，1个是由SRAP引物组合扩增的，1个是由SRAP和AFLP引物组合扩增的。因此SRAP引物多态性比率为0.125%，SRAP-AFLP引物多态性比率为0.305%。通过比较，SRAP引物与其他引物配合使用获得的多态性效率更高。大白菜中，目前已获得与恢复基因连锁的RAPD标记（沈向群和杨文俊，2004），而本研究获得的SRAP标记比RAPD标记更加稳定。甘蓝型油菜中现已发现多个控制雄性不育的寡基因，部分基因已定位到染色体上。其中隐性雄性不育基因Bnms2定位于N16连锁群上，隐性雄性不育基因Bnms3定位于N19连锁群上（Huangetal.，2007），它们分别对应C基因组的第6和第9染色体。隐性雄性不育基因Bnms1定位于N7连锁群（Yietal.，2006），来源于A基因组的第7染色体，而大白菜一复等位雄性不育基因也被定位在A7染色体上。通过以上研究的标记未能确定不育基因与本恢复基因是否在同一位点，但这些基因的定位为本研究中BrMsf3标记的开发、基因定位与克隆打下了良好的基础。4）微卫星标记多态性高符合孟德尔遗传模式共显性遗传等优势，因此，在种群遗传结构分析连锁图谱构建以及系谱认证等工作中，微卫星标记技术得到了广泛的应用。凡纳滨EST对虾数据库包含161075条序列，用SSRIT搜索SSR，结果表明，共获得含的SSR序列12600条(7.8%)，其中包括二核苷酸重复10104条，三核苷酸重复2036条，四核苷酸重复336条，五核苷酸重复35条，六核苷酸重复89条，二核苷酸重复序列是最丰富的重复单元，占80.2%，其次为三核苷酸重复和四核苷酸重复分别占16.1%和2.7%，六核甘酸重复占0.7%五核苷酸最少只有0.3%.引物筛选是分子标记开发的重要过程，本研究通过77个候选EST-SSR标记，共筛选到28对多态性丰富的标记，三核苷酸重复的EST序列中标记的开发会是下一步研究重点，期望在其中筛选出和功能相关联的EST-SSR标记，用于遗传图谱构建和相关研究本研究获得的引物，等位基因数分布于2-5，至于微卫星座位的等位基因数不高是否和样本量较少有关，还需要进一步的验证.5）分子标记辅助选择是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在的选择育种方法该方法不受环境因素的影响而且可进行早期选择和对隐性基因的选择从而有助于提选择效率快育种进程分子标记辅助育种为作物育种特别是玉米杂种优势利用自交系改良等研究提供了新途径.分子标记辅助选择的核心是把常规育种中的表型选择转化为基因型选择从而大大提高育种的选择效果特别是对不能或很难进行表型选择的性状从而有效地减少或避免连锁累赘这种选择方法因不受其他基因效应和环境因素影响结果较为可靠同时在低世代及苗期选择可以大大加快回交导入有利基因改良现有品种的过程缩短育种年限。6）分子标记分析DNA提取：采用CTAB法提取叶片基因组DNA。AFLP分析：选用Invitrogenlifetechnologies的AFLPCoreReagentKit(核心试剂盒)和AFLPSmallGenomePrimerKit。SSR、AFLP两类分子标记扩增32个亲本获得的多态性位点个数分别为550、535,总位点数为1085,以1085分别除第1、第2套组合7个性状筛选得到阳性增效位点的平均值。。总体来看,阳性位点和增效位点数量占总位点(1085)的比例很低,两套平均分别为61%和24%,说明多数标记位点与性状无关,位点筛选十分必要。从不同套双列组合来看,阳性位点数量接近,而增效位点数量总的来看第2套略多于第1套;阳性位点数量因性状差异大,位点多的性状是结实率(两套组合平均为76)和单穗重(75)等,而单株粒重最少(51);增效位点数量在性状上的差异与阳性位点一致,位点最多和最少的性状分别为结实率(345)和单株粒重。通过逐步回归建立预测模型,只保留了与性状相关性较大的少数位点,阳性位点的17。3%和增效位点的310%用于预测模型。从数量来看,用于模型的增效位点(两套均值为8.1)少于阳性位点(11.4),这与增效位点比阳性位点少有关;预测模型位点数量与性状有关,位点数量最多的性状为结实率和千粒重,少的为单株粒重。另外,不同套间预测模型位点数量也存在差异,如阳性位点预测穗实粒数,第1套组合构建的模型使用的位点数量多于第2套,而结实率第1套少于第2套。7)对园艺植物品种的鉴定以往主要采用形态观察和同工酶分析的方法,但由于形态观察受到环境条件和观察者主观性的影响,而同工酶分析又受到可使用的酶种的限制,从而使品种鉴定效率较低、误差较大、一些性状相近的品种难以鉴定。而分子标记可以在DNA水平提供大量的遗传标记,构成DNA指纹图谱,用于鉴定品种的真实性和纯度、确定品种的亲缘关系,以及用于新品种登记和品种知识产权保护等.园艺性状的定位应用分子标记构建的遗传连锁图谱为园艺性状的定位提供了有利条件,使得目的基因的克隆更为方便。DNA分子标记还可以用于观赏植物的杂种优势预测和辅助选择育种。许多观赏植物的育种是通过有性杂交的手段来实现的,而DNA分子标记的应用,使研究人员能够在整个基因组范围内对大量亲本间的遗传距离进行估测,并在此基础上有效地预测具有强优势的组合,指导杂交组合的选配以及杂种优势的分析和预测。Kanyarat等对亚洲杂交百合的育种进行研究时,从278个RAPD标记中找到一个分子标记和一个形态标记(雄性不育)紧密连锁于花的寿命.8)生药成分的获得药用植物的基因与转基因工程可以改变传统遗传性状,培育优良品种,提高有效生药成分含量,增强植物抗病毒和抗虫害的能力,还可以保护和繁殖濒临灭绝的植物材料。运用植物转移病毒的外壳蛋白基因,利用植物病毒的卫星DNA基因及反义RNA等方法,实现药用植物抗病毒能力的提高,如易感染烟草花叶病毒的白花曼陀罗、八角莲等,可用此项技术提高植株的抗病毒能力。转抗虫害的内毒素基因得到抗虫害的植物,对于保护花、果入药的药用植物有重要意义.基因工程与有机合成相结合,可生产中药和发现新的先导物,是缓解药源紧张的有效手段。药用植物中重要酶基因的克隆、重组,可从根本上提高其有效次生代谢产物的含量,获得稳定的生产植株。我国现已克隆出青蒿素生物合成途径中的关键酶基因,东北红豆杉中紫杉醇生物合成途径中起限速作用的紫杉烯合成酶基因等其他相关基因;Wildung等人成功利用PCR(DNA聚合酶链式反应)技术克隆到该酶的cDNA片段,该片段由2586个核苷酸组成,把该cDNA片段导入红豆杉细胞后,将影响紫杉醇含量。还可以利用反义核酸技术,用反义DNA或RNA片段导入植物细胞,控制某一代谢途径上关键酶的活性,从而使成分含量提高,如用反义技术调节亚麻植物毛状根中肉桂醇脱氢酶活性,抑制木质素的合成,使主要抗癌活性成分5-甲基鬼臼素含量提高。9)技术是检测一串红品种(系)遗传多样性的有效工具杨建玉等利用AFLP标记技术对BN35-1株型突变体BN35野生型及4个商品种进行亲缘关系分析，以确定BN35-1与BN35的亲缘关系，又对北京地区常见鼠尾草属植物的7个23种份材料进行AFLP亲缘关系分析，为北京地区开展鼠尾草属植物的种间和种内远缘杂交提供了理论参考然而，从目前的研究情况来看，一串红的实验材料品种(系)最多只有8个，这对于了解一串红种质资源多样性的真实情况还远远不够为此，本课题组收集了17个一串红品种并以此为实验试材，对一串红SRAP-PCR反应体系中的主要因子进行了优化分析，建立了适合一串红DNA的SRAP-PCR扩增体系，64对引物组合中有37对引物的扩增产物在不同材料间具有明显的多态性，其中有1对引物组合的鉴别能力最强，可将所有的17份材料完全区别开，说明SRAP能够有效地揭示不同一串红品种基因组间的差异，可作为一串红品种鉴别的重要技术手段［］接下来利用SRAP标记分析了这些材料的遗传多样性，进一步挖掘一串红品种间遗传基础的多态性信息，为一串红遗传改良和资源创新提供理论基础.10)同工酶标记是显性标